抗L3T4單抗誘導(dǎo)鼠心肌病Th細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分:抗L3T4單抗對(duì)線粒體ADP/ATP載體合成肽誘導(dǎo)的心肌病免疫干預(yù)研究 目的:探討抗L3T4單克隆抗體對(duì)自身免疫性心肌病的免疫治療作用。 方法:以線粒體ADP/ATP載體肽免疫小鼠建立自身免疫性心肌病模型(免疫應(yīng)答組，n=12)；免疫耐受組小鼠(n=6)在被予肽免疫的第-1、0和1天，同時(shí)接受尾靜脈注射抗L3T4單抗；免疫治療組小鼠(n=6)在被予肽免疫的第3個(gè)月接受抗L3T4單抗的治療；以不含肽的相同免疫液免

2、疫小鼠作為對(duì)照組(n=12)。采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗線粒體ADP/ATP載體抗體動(dòng)態(tài)變化及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α的表達(dá)，觀察小鼠心肌組織在光鏡和電鏡下的病理改變，計(jì)算左心室肌中的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)。 結(jié)果:免疫治療組與免疫應(yīng)答組小鼠抗ADP/ATP載體抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性，但前者抗體水平有短暫性下降；免疫耐受組和對(duì)照組均為陰性。與心臟表現(xiàn)正常的對(duì)照組相比，在免疫的第30天，免疫應(yīng)答組細(xì)胞因

3、子表達(dá)均增高(P均＜0.01)，且以IFN-γ和IL-2為明顯，心臟出現(xiàn)類心肌炎樣改變；在第180天以IL-4、IL-6和TNF-α增高明顯，心臟出現(xiàn)類擴(kuò)張型心肌病樣變。免疫治療組變化與免疫應(yīng)答組相似，但第180天的細(xì)胞因子增高水平較之偏低(P均＜0.01)、心臟損傷較之略輕；免疫耐受組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。 結(jié)論:抗L3T4單抗能抑制抗線粒體ADP/ATP載體抗體的產(chǎn)生與細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)線粒體ADP/ATP載體肽誘導(dǎo)的

4、小鼠自身免疫性心肌病有治療作用，且早期療效更為明顯，能誘導(dǎo)免疫耐受。 第二部分:抗L3T4單抗對(duì)自身免疫性心肌病小鼠的T細(xì)胞受體信號(hào)通路的影響 目的:通過研究T細(xì)胞信號(hào)分子的表達(dá)，探討抗L3T4單抗抑制自身免疫性心肌病發(fā)生的分子機(jī)制。 方法:以線粒體ADP/ATP載體肽免疫小鼠以建立自身免疫性心肌病動(dòng)物模型(免疫應(yīng)答組，n=12)；在予相同肽免疫的前期和后期分別加予抗L3T4單抗進(jìn)行干預(yù)，建立免疫耐受組(n=6)

5、和免疫治療組(n=6)小鼠模型；以不含肽的相同免疫液免疫小鼠作為對(duì)照(n=12)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組小鼠T細(xì)胞內(nèi)P56lck、P59fyn、Zap-70及細(xì)胞因子的表達(dá)，三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其Th亞群的分布，免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察其T細(xì)胞表面CD45的表達(dá)，比色法檢測(cè)其T細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)的活性。 結(jié)果:在免疫的第30天和第180天，對(duì)照組小鼠各檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；與對(duì)照組相比，在第30天，免疫應(yīng)答組小鼠T

6、細(xì)胞內(nèi)P56lck、P59fyn、Zap-70及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-4的基因表達(dá)、Th1/Th2亞群的百分含量、CD45的表達(dá)強(qiáng)度和CaN活性均明顯增高(P均＜0.01)，且以IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)及Th1亞群含量增高更為顯著；在第180天，P561ck、P59fyn、Zap-70及IL-6和IL-4的基因表達(dá)、Th2亞群含量、CD45的表達(dá)強(qiáng)度和CaN活性增高更為明顯；而此時(shí)免疫治療組也有類似改變，但

7、其各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)水平均低于免疫應(yīng)答組(P均＜0.01)；免疫耐受組與對(duì)照組相比，P56lck偏高，但其明顯低于免疫應(yīng)答組和免疫治療組(P均＜0.01)，余較對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。 結(jié)論:抗L3T4單抗通過調(diào)控T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制線粒體ADP/ATP載體肽誘導(dǎo)自身免疫性心肌病的發(fā)生和發(fā)展。 第三部分:抗L3T4單抗誘導(dǎo)小鼠對(duì)線粒體ADP/ATP載體肽免疫耐受的“感染性”研究 目的:驗(yàn)證抗L3T4單抗誘導(dǎo)小鼠對(duì)線

8、粒體ADP/ATP載體肽的免疫耐受是否具有“感染性”。 方法:將第一部分實(shí)驗(yàn)中的第180天的各組小鼠殺死，取其新鮮脾細(xì)胞分別過繼轉(zhuǎn)輸給另外3組同源近交系Balb/c小鼠：(1)DCM過繼組(n=6)：接受免疫應(yīng)答組小鼠脾細(xì)胞；(2)耐受過繼組(n=6)：接受免疫耐受組脾細(xì)胞；(3)過繼對(duì)照組(n=6)：接受正常對(duì)照組的脾細(xì)胞，并在過繼后予與第一部分實(shí)驗(yàn)相同的線粒體ADP/ATP肽免疫耐受過繼組。采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠的血清

9、抗ADP/ATP載體自身抗體，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4基因表達(dá)，以3色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2亞群的分布，并用光鏡與電鏡進(jìn)行心臟形態(tài)學(xué)和心肌病理組織學(xué)觀察。 結(jié)果:DCM過繼組小鼠血清抗ADP/ATP自身抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性，耐受過繼組與過繼對(duì)照組均為陰性。在過繼后的第180天，與正常的過繼對(duì)照組相比，DCM過繼組小鼠T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4mRNA表達(dá)水平

10、均明顯增高，且以IL-4更為顯著(P均＜0.01)；Th1/Th2細(xì)胞亞群百分含量均增多，且以Th2亞群更為明顯(P均＜0.01)；心臟出現(xiàn)類擴(kuò)張型心肌病樣改變。耐受過繼組細(xì)胞因子水平和Th細(xì)胞亞群分布較對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，心臟形態(tài)及心肌組織病理學(xué)檢查均無(wú)明顯異常改變。各組小鼠檢測(cè)指標(biāo)分別與相應(yīng)的過繼前免疫應(yīng)答組、免疫耐受組和對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異。 結(jié)論:抗L3T4單抗能抑制線粒體ADP/ATP載體肽誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生自身免疫