Sema3A誘導少突膠質(zhì)細胞祖細胞遷移及其信號轉導機制的初步研究.pdf

1、研究目的： 1、觀察Sema3A-Fc對少突膠質(zhì)細胞祖細胞遷移的影響； 2、探討cAMP-PKA、cGMP-PKG和RhoA-ROCK信號通路在Sema3A-Fc誘導少突膠質(zhì)細胞祖細胞遷移中的作用； 3、試圖闡明Sema3A誘導少突膠質(zhì)細胞祖細胞遷移中可能的信號機制。 實驗方法： 1、少突膠質(zhì)細胞祖細胞的分離培養(yǎng)與鑒定在解剖顯微鏡下切取新生SD大鼠室管膜下區(qū)腦組織進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％小牛

2、血清和10％胎牛血清的DMEM。細胞分層時由于OPCs生長在星形膠質(zhì)細胞層上面，根據(jù)貼壁能力差異，采用差速振蕩法分離上層的OPCs。OPCs采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含2％B27，20ng/LbFGF和20ng/LPDGF-AA)進行擴增培養(yǎng)。分別用無血清培養(yǎng)基和血清培養(yǎng)基對OPCs進行促分化培養(yǎng)。分別選取少突膠質(zhì)細胞系不同發(fā)育期標志性抗原(A285、GFAP和CNPase)，采用間接免疫熒光染色技術對所培養(yǎng)的細胞進行類型鑒定。EGF

3、P質(zhì)粒轉染體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞祖細胞，挑選成功轉染GFP的少突膠質(zhì)細胞祖細胞擴增培養(yǎng)備用。 2、表達Sema3A-Fc的COS-7細胞的制備利用基因重組技術，構建Sema3A-Fc重組質(zhì)粒，利用雙酶切、基因測序進行重組質(zhì)粒鑒定；脂質(zhì)體法轉染COS-7細胞，G418篩選抗性克隆，擴增培養(yǎng)，免疫組化和免疫印跡法鑒定重組蛋白表達情況，獲得穩(wěn)定表達Sema3A的COS-7細胞。用含有sema3A-Fc培養(yǎng)上清加入體外培養(yǎng)的OPCs培養(yǎng)

4、瓶中，通過對比觀察構建表達的sema3A-Fc是否具有生物學活性。并對細胞膜上NP-1受體進行了檢測。 3、Sema3A-Fc誘導少突膠質(zhì)細胞祖細胞遷移信號機制的實驗研究 1)用millicell-PCF細胞遷移小室(孔徑8um)進行細胞遷移試驗。將穩(wěn)定表達Sema3A-Fc的COS-7細胞培養(yǎng)在遷移倉下層，待細胞融合達70％以上后，將純化培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞祖細胞按2x104/孔接種在遷移倉的上層，共培養(yǎng)12h后，固定細

5、胞，甲苯胺藍染色，計數(shù)遷移細胞數(shù)。設對照組：單純培養(yǎng)基對照和轉染pIG的COS-7對照組。 2)PKA和PKG的激活實驗：分別加入cAMP類似物8-溴-cAMP(濃度50μM)，cGMP類似物8-溴-cGMP(濃度500μM)于分層遷移實驗艙下層中，觀察少突膠質(zhì)細胞祖細胞的遷移情況，計數(shù)并比較遷移結果。 3)PKA和PKG抑制實驗：分別加入PKA的特異性抑制物KT5720(濃度10μM)和PKG的特異性抑制物KT5823

6、(濃度1μM)于分層遷移實驗艙下層中，觀察少突膠質(zhì)細胞祖細胞的遷移情況，計數(shù)并比較遷移結果。 4)抑制Rock激酶試驗：分別在上述實驗組中加入有Rho活性的ROCK激酶抑制物Y27632(濃度10μM)，分別觀察少突膠質(zhì)細胞祖細胞的遷移情況，計數(shù)并比較遷移結果。 5)免疫熒光法檢測PKAα催化亞基和PKG1含量：分別用小鼠抗PKAα催化亞基抗體和兔抗PKG1抗體做為一抗，PBS替代-抗作陰性對照，在相同條件下進行免疫熒光

7、染色和照相。用Image-ProPlus5.1圖像分析軟件，對圖像進行分析處理。 6)觀察PKG，PKA和ROCK活性對OPCs細胞遷移的直接作用。在沒有sema3A-Fc存在的情況下，用8-Br-cAME8-Br-cGMP,KT5720、KT5823和Y27632直接作用于OPCs細胞(濃度同前)，觀察PKG，PKA和ROCK活性改變是否對體外培養(yǎng)的OPCs細胞遷移的產(chǎn)生直接影響。 4、統(tǒng)計 定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標

8、準差(x±s)表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，使用獨立樣本t檢驗分析兩個組間的差異，使用單因素方差分析比較多個組間統(tǒng)計學差異。以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，以P＜0.01為有顯著差異。 主要結果： 1、體外成功分離培養(yǎng)出少突膠質(zhì)細胞祖細胞，A285標記陽性，純度達到95％以上。并能進一步分化為CNPase標記陽性的少突膠質(zhì)細胞和GFAP標記陽性Ⅱ型星形膠質(zhì)細胞。 2、成功構建了pIGsema3A-

9、Fc重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(HindⅢ和BamHⅠ)和基因測序鑒定正確，轉染COS-7細胞后，經(jīng)免疫組化和Western-blot檢測到重組蛋白的表達。表達Sema3A-Fc的COS-7細胞的培養(yǎng)上清能夠促使體外培養(yǎng)的OPCs細胞突起回縮，胞體變圓。用抗Fc抗體和抗NP-1抗體免疫熒光染色均呈膜性染色。 3、sema3A-Fc誘導細胞遷移實驗結果：Sema3A-Fc實驗組OPCs遷移數(shù)為(24.3±6.7)，單純培養(yǎng)基對照組為(38

10、.4±7.9)，轉染pIG的COS-7對照組為(37.7±8.3)，實驗組與兩個對照組均存在明顯差異(n=15，P＜0.01)。 4、OPCs細胞內(nèi)PKG、PKA免疫組化檢測：通過針對催化亞基的抗體用免疫熒光法對細胞內(nèi)PKA和PKG進行檢測，發(fā)現(xiàn)OPCs細胞內(nèi)的PKA和PKG均有基礎量的表達，主要分布在胞漿和突起內(nèi)。當加入含sema3A-Fc的培養(yǎng)上清時，細胞內(nèi)PKAα催化亞基染色強度沒有明顯變化，而PKG1的染色強度則較對照組

11、明顯增高(P＜0.01)，表明PKG含量增加，活性增強。表明含sema3A-Fc激活了cGMP-PKG信號通路。 5、PKA和PKG激活/抑制實驗：OPCs遷移數(shù)分別為：8-溴-cAMP組OPCs遷移數(shù)為(32.6±7.3)較對照組(24.3±6.7)明顯增加(P＜0.01)，8-溴-cGMP組為(19.3±5.5)較對照組(24.3±6.7)有減少明顯(P＜0.05)。PKA和PKG抑制實驗：OPCs遷移數(shù)分別為：KT5720

12、組(17.5±5.3)較對照組(24.3±6.7)明顯減少(P＜0.01)。KT5823組(29.9±6.2)較對照組(24.3±6.7)有明顯增加(P＜0.05)。表明PKG通路對sema3A信號具有正向調(diào)節(jié)作用，而PKA通路則具有負向調(diào)節(jié)作用。 6、抑制ROCK激酶試驗：Y27632干預前后的成對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結果為，對照組(37.7±8.3)對(38.4±8.2)，sema3A-Fc組(24.3±6.7)對(35.3±8.7)

13、，8-溴-cAMP組(32.6±7.3)對(32.4±7.6)，8-溴-cGMP組(19.3±5.5)對(29.9±6.2)，KT5720組(17.5±5.3)對(26.5±5.7)，KT5823組(29.9±6.2)對(36.9±7.7)。單因素方差分析示組間有明顯差異(P=0.012)。表明ROCK激酶抑制劑Y27632能明顯抑制sema3A-Fc對OPCs細胞遷移的作用，間接證明Sema3A激活了OPCs細胞內(nèi)的Rho-ROCK信

14、號通路。 7、在去除Sema3A-Fc情況，單獨應用8-Br-cGMP、8-Br-cAMP、KT5720、KT5823和Y27632并不能改變OPCs原有的遷移能力。結果為：8-溴-cAMP組(36.8±7.1)，8-溴-cGMP組(35.1±7.4)，KT5720組(37.5±8.1)，KT5823組(34.9±7.6)，均與對照組(37.7±8.3)無明顯差異(n=15，P＞0.05)。但與sema3A-Fc存在時的數(shù)據(jù)進行

15、配對比較則有明顯差異(P＜0.05)。 全文結論： 1、通過二次接種和差速振蕩法，成功分離出高純度少突膠質(zhì)細胞祖細胞，傳代及分化培養(yǎng)，通過免疫組化法鑒定了細胞類型。脂質(zhì)體法成功導入EGFP基因，成為可示蹤的少突膠質(zhì)細胞祖細胞。 2、成功構建了pIGsema3A-Fc真核表達載體，通過脂質(zhì)體法成功轉染COS-7細胞，表達出具有生物活性的sema3A融合蛋白。 3、Sema3A-Fc對體外培養(yǎng)的OPCs細胞遷