新生小牛與成人皮膚組織學(xué)及生物力學(xué)性能的比較和牛脫細胞真皮基質(zhì)的制備.pdf

1、大面積燒傷、創(chuàng)傷患者救治的關(guān)鍵是如何及時有效的封閉創(chuàng)面。真皮成分的缺乏成為皮膚移植術(shù)后患者植皮區(qū)愈后外觀及功能的主要影響因素，因此真皮移植和/或真皮替代物的研究成為改善燒傷、創(chuàng)傷和整形患者的預(yù)后，提高其生活質(zhì)量的關(guān)鍵之一。由細胞外基質(zhì)(ECM)組成的生物支架材料已經(jīng)應(yīng)用于各種外科重建并作為一種再生醫(yī)學(xué)策略廣泛應(yīng)用于組織和器官替代。細胞外基質(zhì)成分生物支架材料的來源有多種動物，由于細胞外基質(zhì)成分生物支架有特殊的機械性能、保留了生物活性可促進

2、組織再生，所以這些蛋白為基礎(chǔ)的材料與人工合成材料在外科和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中有許多天然的優(yōu)勢。由于異體真皮的來源及其有限且價格昂貴，因此有必要選擇一種與人真皮相對接近的異種真皮來源。在本課題組前期工作的基礎(chǔ)上，我們選擇了新生小牛皮膚，探討與人皮膚組織結(jié)構(gòu)、主要組成成分及其比例上的差異及生物力學(xué)性能特點，為臨床應(yīng)用牛真皮基質(zhì)提供實驗依據(jù)。并且對制備新生小牛脫細胞真皮基質(zhì)的方法進行了探索，利用滲透沖擊聯(lián)合超聲和去污劑處理的方法制備出了較為理想的

3、異種脫細胞真皮基質(zhì)，對所制備的脫細胞真皮基質(zhì)的組織學(xué)和生物活性成分與天然真皮基質(zhì)進行了對比。
　　 目的
　　 1.通過新生小牛與成人皮膚組織在形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)性能方面的對比研究，尋找二者之間的異同點，為臨床應(yīng)用牛真皮基質(zhì)提供實驗依據(jù)。
　　 2.探索新生小牛脫細胞真皮基質(zhì)的制備方法，觀察處理前后真皮基質(zhì)的組織學(xué)和生物活性成分的變化。
　　 方法
　　 1.收集新生小牛和成人背部全層皮膚標(biāo)本，采用

4、大體觀察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩紅染色、Gomori醛復(fù)紅染色、掃描電鏡和透射電鏡的方法，顯微照相后進行形態(tài)學(xué)觀察和圖像分析軟件的測量并制備新生小牛和成人皮膚生物力學(xué)試件，采用力學(xué)生物材料試驗機檢測皮膚的力學(xué)性能。
　　 2.收集并制備新生小牛網(wǎng)狀層真皮，分別采用酶學(xué)法、滲透沖擊聯(lián)合去污劑法及滲透沖擊聯(lián)合超聲和去污劑法探索制備脫細胞真皮基質(zhì)，對制備出的脫細胞真皮基質(zhì)采用大體觀察和HE染色確定較為理想的制備方法；<

5、br>　　 3.對制備出的脫細胞真皮基質(zhì)進行HE染色、DAPI染色和核酸電泳檢測細胞成分殘留情況；掃描電鏡(SEM)觀察膠原束結(jié)構(gòu)和細胞成分；PicoGreen法、DMMB法和BCA法對脫細胞前后真皮基質(zhì)的DNA、sGAG和蛋白質(zhì)含量進行定量分析；ELISA法測定脫細胞前后真皮基質(zhì)內(nèi)TGF-β1、EGF、bFGF和KGF含量。
　　 結(jié)果
　　 1.新生小牛與人的皮膚比較，真皮和表皮的厚度均明顯變薄，兩者的比值顯著減小

6、；真皮內(nèi)Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維分別較人真皮增多和減少，但真皮膠原纖維束的間隙率[(41.72±1.81)vs(40.66±1.40)，P=0.467]和膠原纖維束粗細[(11.28±0.18)vs(10.88±0.66)，P=0.368]均沒有統(tǒng)計學(xué)差異；
　　 2.掃描電鏡觀察可見新生牛真皮膠原纖維束與人真皮膠原纖維束均較纖細，排列疏松，且有一定的孔隙分布；透射電鏡顯示新生牛真皮膠原原纖維橫紋周期長度較人真皮長，但兩者的膠原原纖維

7、直徑無顯著差異。
　　 3.生物力學(xué)檢測示新生牛皮膚最大應(yīng)力(21.08±0.91)MPa和楊氏模量(82.12±1.23)MPa均要明顯高于人皮膚的最大應(yīng)力(12.76±1.60)MPa(P=0.001)和楊氏模量(48.63±5.50)MPa(P=0.001)，而最大應(yīng)變卻明顯低于人真皮[(0.51±0.002)mm vs(0.75±0.028)mm(P=0.001)]。
　　 4.酶學(xué)法可以制備出脫細胞真皮，但對網(wǎng)

8、狀層真皮要求較高，要求網(wǎng)狀層真皮厚薄均勻，并且對制作網(wǎng)狀層真皮的部位有一定要求；滲透沖擊聯(lián)合去污劑法所制備的脫細胞真皮HE染色觀察細胞核去除較徹底，但所使用去污劑對膠原有一定程度破壞，變現(xiàn)為膠原纖維束松散，部分呈團塊狀；滲透沖擊聯(lián)合超聲去污劑處理制備的脫細胞真皮HE染色觀察細胞核去除較為徹底，膠原纖維束排列疏松，未見膠原纖維束結(jié)構(gòu)明顯破壞，DAPI染色未見真皮內(nèi)有DNA著色，掃描電鏡結(jié)果顯示膠原纖維束排列疏松，未發(fā)現(xiàn)細胞存留。
　

9、　 5.成分定量分析證實DNA含量[(2516.1±324.2)ng/mg vs(249.5±53.8)ng/mg，P=0.000)，下降了90.1%，sGAG含量[(5.92±0.50)μg/mg vs(2.48±0.24)μg/mg，P=0.000]，含量保留約41.9%。與脫細胞前比較，含水量有所下降[(72.83+1.43)% vs(69.68+1.78)%，P<0.05]。細胞因子檢測TGF-β1含量[(478.8±196.

10、1)pg/g vs(180.3±111.0)pg/g，P=0.009]和EGF含量[(10.52±2.78)pg/g vs未能檢測到EGF含量]均明顯減少；而bFGF含量[(788.6±333.8)pg/g vs(364.8±294.8)pg/g，P=0.424]下降了53.7％，KGF含量[(0.033±0.00019)pg/g vs(0.033±0.00022)pg/g，P=0.433]變化不顯著。
　　 結(jié)論