茶黃素衍生物作為候選殺微生物劑用于預防HIV性傳播的研究.pdf

1、研究背景：
　　 全球范圍內(nèi),艾滋病疫情日益嚴重。艾滋病病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)經(jīng)性傳播是艾滋病流行的首要途徑。全球90％的感染者是通過性傳播而感染上HIV病毒的,其中女性感染者比例呈逐漸增加的趨勢。為降低HIV性傳播或性傳播疾病采取了很多預防措施,包括禁欲、一夫一妻制、常規(guī)使用安全套以及男性包皮環(huán)切術。但是對于HIV高致病地區(qū)的婦女,由于社會、經(jīng)濟和文化因素不能有效利用上述預防措施

2、。因此,開發(fā)有效的殺微生物劑來預防HIV的性接觸傳播是目前全球艾滋病預防的首要任務和重要課題。
　　 最近幾年有關HIV-1病毒和細胞膜融合導致病毒基因組進入宿主細胞的分子過程已逐漸被闡明。在HIV的感染過程中,首先是HIV包被膜與靶細胞的細胞膜發(fā)生融合。HIV與靶細胞融合主要由包膜糖蛋白gp160(由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共價結合形成)介導。gp120與靶細胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR

3、5或CXCR4等)依次結合,導致gp41的構型發(fā)生改變,形成六股α-螺旋束核心結構,將病毒包膜與靶細胞膜拉近并發(fā)生融合,完成病毒進入靶細胞的感染過程。這些對病毒進入機制的研究使得干涉病毒進入的治療和預防成為可能。
　　 天然產(chǎn)物由于具有來源廣泛、結構多樣、有效和低毒等特點,使天然來源HIV進入抑制劑成為近年來研究和開發(fā)新型抗HIV-1藥物的熱點。茶黃素是紅茶中的主要成分,是一類具有苯駢卓酚酮結構的物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的茶黃素種

4、類共有28種,其中茶黃素(TF或TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(TF-3'-G或TF2B)和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(TFDG或TF3)是4種最主要的茶黃素。目前國內(nèi)外大量研究證實其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用,是一類極具開發(fā)潛力的天然產(chǎn)物。我們曾報道過紅茶中的茶黃素單體成分能特異性地作用于gp41,抑制gp41六螺旋核心結構的形成。根據(jù)gv41晶體結構

5、進行的計算機輔助藥物模擬技術也表明TF3能結合到gv41的疏水性空穴中。
　　 盡管可以將上述茶黃素單體化合物作為殺微生物劑進行開發(fā),但單體成分不穩(wěn)定,且難于分離純化。為此,我們制備了包含上述四種茶黃素單體(含量達到90％)的茶黃素衍生物,并證明其在酸性環(huán)境下(pH<6)性質(zhì)非常穩(wěn)定。健康女性的陰道環(huán)境維持在pH 4.0～5.0的酸性環(huán)境中,該環(huán)境有利于增強自然防御,因此茶黃素衍生物在酸性環(huán)境中穩(wěn)定的性質(zhì)更有利于將其開發(fā)為陰道用

6、殺微生物劑。由此可見,茶黃素衍生物若開發(fā)成陰道用殺微生物劑預防HIV的性傳播,將具有價廉、安全、穩(wěn)定的優(yōu)點。
　　 目的：
　　 本文研究茶黃素衍生物(包括TF1、TF2A、TF2B、TF3四種茶黃素,四種成分總含量為90％)抗HIV的作用機制。同時,將茶黃素衍生物(TF)制備為2％TF凝膠劑進行研究,從細胞水平和動物水平進行TF凝膠劑的有效性及安全性評價,為最終成功開發(fā)一種安全、有效、穩(wěn)定的抗HIV殺微生物劑候選分子奠

7、定基礎。
　　 方法:
　　 1.由于茶黃素單體成分在中性或堿性環(huán)境中不穩(wěn)定,且分離純化的成本高。本研究以茶黃素衍生物(TF)為研究對象,用反相高效液相色譜法分析其所含成分。
　　 2.EIASA法檢測TF對HIV-1實驗室適應性病毒株和耐藥株的抑制活性,同時采用XTT法評價TF對人免疫細胞的毒性。
　　 3.采用時間過程實驗、細胞-細胞融合方法初步確定TF在病毒復制周期中的作用機制和藥物靶點。
　

8、　 4.用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(N-PAGE)、分子排阻高效液相色譜法(SE-HPLC)檢測其抑制HIV gp41六螺旋束結構形成的活性。檢測TF抑制HIV gp120與CD4結合的活性。同時,檢測TF對HIV逆轉錄酶的抑制活性。
　　 5.PAP251-286為衍生于精液中前列腺酸性磷酸酶(prostatic acidic phosphatase,PAP)的多肽,具有促進HIV感染的活性,被稱

9、為精液來源的病毒增強肽(semen-derived enhancer of viral infection,SEVI)。用透射電子顯微鏡觀察PAP251-286形成的原纖維的顯微結構,研究TF對于SEVI形成的淀粉樣纖維的降解作用。
　　 6.比較TF在不同pH檸檬酸-磷酸緩沖溶液中的穩(wěn)定性。
　　 7.在單因素考察的基礎上,以規(guī)定時間的累積滲透量和TF凝膠劑粘度為指標,選取卡波姆濃度、氮酮、丙二醇的用量三個因素進行正交

10、試驗設計優(yōu)化最佳處方。對TF凝膠劑的穩(wěn)定性進行了初步研究,包括耐熱實驗、耐寒實驗、離心實驗。
　　 8.用XTT法檢測2％TF凝膠對人永生化陰道細胞(VK2/E6E7,Ect1/E6E7 andEnd1/E6E7)的毒性。通過皮膚過敏性實驗以及家兔陰道粘膜刺激性實驗,對家兔陰道使用2％TF凝膠劑進行初步安全性評價。采用PCNA免疫組化評價家兔陰道組織的炎癥。ELISA法檢測家兔陰道灌洗液中促炎細胞因子(IL-1β、IL-6、IL

11、-8和TNF-α)和免疫調(diào)節(jié)細胞因子(IL-10和GM-CSF)的水平。
　　 9.采用HPLC法考察2％TF凝膠劑的體內(nèi)吸收。
　　 結果:
　　 1.TF主要含有茶黃素(TF或TF1)、茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(TF-3-G或TF2B)和茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(TFDG或TF3)4種茶黃素。四種茶黃素的總含量為90％。
　　 2.TF能高效抑制

12、多種HIV-1實驗室病毒株包括HIV-1X4型和R5型病毒,而且對耐藥株感染也有顯著的抑制活性。表明TF具有極為廣譜的抗病毒活性。通過細胞毒性試驗證明TF對人免疫細胞無毒性。
　　 3.時間過程實驗結果顯示TF在病毒感染后2小時加入時,對病毒已無明顯抑制活性,在病毒感后1小時之內(nèi)加入時,才顯示很強的抑制活性,表明TF作用于病毒生活周期的早期。加入TF后H9/HIV-1ⅢB和MT2細胞混合培
　　 養(yǎng)后融合形成大量合胞體數(shù)

13、目明顯減少,其抑制率隨著劑量的加大而增加,IC50為1.788μg/ml,表明TF有效抑制HIV包膜介導的細胞融合。通過這兩個實驗我們可以推測TF通過抑制HIV包膜介導的細胞融合從而阻止HIV的進入。
　　 4.N36和C34是從HIV gp41的NHR和CHR區(qū)衍生出來的多肽,二者在體外能形成類似gp41 NHR和CHR結合的螺旋結構。因此,抗gp41六螺旋束核心結構的活性可以用抑制N36和C34結合的作用來測定。
　　

14、 5.人精液中的多肽PAP251-286,即SEVI,能形成淀粉樣原纖維,促進HIV感染。因此,SEVI被認為是促進HIV性傳播的主要因素。電鏡下觀察到PAP251-286在濃度為8 mg/ml能形成大量典型的淀粉樣原纖維的結構并且能穩(wěn)定存在36小時。TF在2 mg/ml時能形成細小聚集物。TF與PAP251-286形成的原纖維37℃共同孵育36小時后,纖維結構明顯破壞分解。表明TF能夠破壞SEVI淀粉樣原纖維的結構,從而阻止精液導致

15、的HIV感染。
　　 6.當TF在pH 3～6的環(huán)境中,24小時內(nèi)HPLC色譜峰沒有明顯的改變。相反,當TF在pH為7～9的環(huán)境中4小時后含量減少,且大部分TF在24小時后完全降解。表明TF在pH酸性環(huán)境中穩(wěn)定。
　　 7.處方含有2％TF最適合臨床前和臨床研究。4％TF凝膠由于含有高濃度的有效成分使其長時間不能被吸收。正交試驗設計優(yōu)化的最佳處方為卡波姆974P濃度為1％,甘油濃度為0.75％,丙二醇濃度為15％(w/w

16、)。所制凝膠pH為4.1～4.7。TF凝膠劑經(jīng)體外釋放過程符合Higuchi方程。TF凝膠劑在室溫條件下穩(wěn)定性良好。
　　 8.TF對3種人正常陰道及子宮頸組織上皮細胞的細胞毒性作用均很低,且選擇指數(shù)超過100。TF凝膠未見皮膚過敏性。
　　 9.2％TF凝膠單次陰道給藥后不會產(chǎn)生系統(tǒng)吸收。然而,在給藥1小時后的陰道灌洗液中檢測到較高濃度的茶黃素。更為重要的是,即使是給藥6小時以后,仍然有TF殘留,表明TF可以作為每天只

17、用1次的殺微生物劑進行研發(fā)。
　　 結論:
　　 通過對TF體外藥效學研究,發(fā)現(xiàn)茶黃素衍生物(TF)具有廣譜的抗HIV活性。TF可通過多種機制抑制HIV的復制,為多靶點的HIV進入抑制劑,包括抑制HIV gp41六股螺旋束結構的形成,阻止gp120與CD4的結合。在高濃度時,TF還能抑制HIV逆轉錄酶的活性。尤其值得注意的是,表明TF能夠破壞SEVI形成的淀粉樣原纖維,從而阻止精液導致的HIV感染。由此可見,TF抑制HI

18、V的作用機理明確、來源廣泛、價廉,若將其作為第二代殺微生物劑用于預防HIV的性傳播,有顯著的優(yōu)越性和可行性。
　　 本研究進一步將TF制備為陰道用凝膠劑,確定最佳處方為TF為2％,卡波姆974P濃度為1％,甘油濃度為0.75％,丙二醇濃度為15％(w/w)。作為理想的殺微生物劑,另一個必要條件是對人體安全無毒。體外安全性實驗表明2％TF凝膠劑無毒性和刺激性,不會導致細胞炎癥或者陰道上皮細胞的超常增生,并且不能吸收入血產(chǎn)生系統(tǒng)副作