候選殺微生物劑對(duì)陰道乳酸桿菌的安全性評(píng)價(jià)及其抗HSV-2活性的研究.pdf

1、研究背景:
　　 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immune Deficiency Virus,HIV)引起的一種全身性免疫抑制疾病,以接近100％的高致死率嚴(yán)重危害著人類健康。但自1981年首次發(fā)現(xiàn)艾滋病以來(lái),仍沒(méi)有找到有效的預(yù)防措施,HIV繼續(xù)以每日約8000個(gè)新增感染病例的速度在全球蔓延。值得強(qiáng)調(diào)的是,感染者中約有50％為女性,特別是在撒哈拉以南的非洲,女性感染率高達(dá)67％。在男性拒絕的情況下,一些諸如:避孕套,

2、單性伴等預(yù)防性措施作用難以取得效果。這就急需一種具有女性自控性的預(yù)防措施出現(xiàn),如殺微生物劑(Microbicide)。早在上個(gè)世紀(jì)90年代,“Microbicide"這個(gè)名詞已經(jīng)進(jìn)入預(yù)防HIV的研究領(lǐng)域,特指在陰道或直腸局部使用的具有抗HIV和其他病原體作用的抗微生物制劑。迄今為止,還沒(méi)有一個(gè)殺微生物劑產(chǎn)品正式上市使用,但殺微生物劑候選產(chǎn)品的研究已經(jīng)進(jìn)入了第三代。第一代殺微生物劑以非離子表面活性劑N-9(Nonoxynol-9)為代表,

3、它是第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的殺微生物劑。N-9在作為殺微生物劑進(jìn)行研究之前,已經(jīng)在臨床上作為殺精子劑應(yīng)用超過(guò)25年之久。由于價(jià)格便宜,而且在體外和動(dòng)物模型的抗HIV實(shí)驗(yàn)中證明有效,N-9很快進(jìn)入了預(yù)防HIV性傳播的大規(guī)模臨床試驗(yàn),但因其損傷陰道上皮細(xì)胞,破壞粘膜組織完整性,非但沒(méi)有降低反而增加了受試人員感染HIV的比率,因而最終退出殺微生物劑的行列。也正是N-9的失敗,殺微生物劑對(duì)陰道的安全性評(píng)價(jià)越來(lái)越受人們關(guān)注,至今已經(jīng)成為篩選殺微生物劑

4、的首要條件。
　　 目的:
　　 1、通過(guò)對(duì)女性陰道內(nèi)乳酸桿菌的收集,分離與純化；鑒定出乳酸桿菌的菌種,而后將候選殺微生物劑對(duì)已鑒定的菌種進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),來(lái)觀察候選殺微生物劑對(duì)陰道乳酸桿菌的安全性。
　　 2、通過(guò)對(duì)候選殺微生物劑進(jìn)行抗HSV-2病毒實(shí)驗(yàn),來(lái)觀察候選殺微生物劑是否具有抗HSV-2病毒活性。
　　 方法:
　　 1.女性陰道內(nèi)乳酸桿菌的樣本收集,分離與純化
　　 在婦科門(mén)診病人

5、中,用無(wú)菌試管收集陰道分泌物,并在2h內(nèi)將其轉(zhuǎn)移到細(xì)菌室。將陰道分泌物接種在乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)瓊脂板上,并將接種板置于厭氧盒中,37℃恒溫培養(yǎng)72h。72h后觀察接種板的菌落生長(zhǎng)情況,根據(jù)菌落生長(zhǎng)的大小、形態(tài)、顏色、粗糙程度以及氣味初步判斷可疑菌株,并對(duì)可疑菌株進(jìn)行涂片、革蘭染色,并在油鏡下觀察其細(xì)菌的形態(tài),染色情況；將革蘭染色陽(yáng)性,且形狀為桿狀的可疑菌落,進(jìn)行觸酶實(shí)驗(yàn)。將革蘭染色陽(yáng)性,觸酶實(shí)驗(yàn)陰性的可疑單個(gè)菌落接種于

6、另一新的MRS培養(yǎng)基瓊脂板上,進(jìn)行菌株純化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件仍為厭氧、37℃恒溫。
　　 2.陰道乳酸桿菌的生化鑒定
　　 采用法國(guó)bioMérieux公司的API 50 CHL鑒定條碼和API細(xì)菌鑒定系統(tǒng),對(duì)陰道乳酸桿菌進(jìn)行生化鑒定,方法依據(jù)該鑒定條碼說(shuō)明書(shū)。
　　 3.陰道乳酸桿菌的分子鑒定
　　 將冷凍于-80℃冰箱的陰道乳酸桿菌,迅速置于37℃水浴鍋內(nèi),溶化復(fù)蘇。然后將其加入到MRS Broth培養(yǎng)基

7、中,封口,置于37℃恒溫?fù)u床中擴(kuò)增。應(yīng)用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)菌DNA進(jìn)行抽提；將抽提的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定后,根據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒要求,進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增；然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,電泳產(chǎn)物進(jìn)行凝膠成像采集并根據(jù)需要將可疑條帶進(jìn)行割膠回收:根據(jù)凝膠回收試劑盒的步驟,對(duì)上述的膠條進(jìn)行DNA回收；測(cè)定回收DNA濃度,并將其送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用Vector NTI 8.0序列分析軟件對(duì)各菌株進(jìn)行菌種鑒定。
　　

8、 4.候選殺微生物劑對(duì)陰道乳酸桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)
　　 將分子鑒定為乳酸桿菌的菌株,進(jìn)行復(fù)蘇,擴(kuò)增；測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的麥?zhǔn)隙?MCF,用于測(cè)定細(xì)菌濃度的單位),然后將其稀釋到0.5 MCF(利用MRS Broth培養(yǎng)基稀釋)。將候選殺微生物劑按照濃度梯度,加入細(xì)胞培養(yǎng)用96孔板內(nèi),50μl/孔；再將上述稀釋的0.5 MCF的細(xì)菌懸浮液繼續(xù)以1:100的比例稀釋,并將此懸浮液加入到上述裝有候選殺微生物劑的96孔板內(nèi),50μl/孔?；靹蚝?/p>

9、,將細(xì)胞板置于厭氧盒內(nèi),并將厭氧盒放在37℃恒溫箱內(nèi),48 h后肉眼和鏡下觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,得出每種候選殺微生物劑對(duì)陰道乳酸桿菌的MIC(最低抑菌濃度),從而判斷候選殺微生物劑對(duì)陰道乳酸桿菌的藥物敏感性。
　　 5.HSV-2病毒復(fù)蘇,接種與培養(yǎng)
　　 將Vero細(xì)胞接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞90％鋪滿瓶底部時(shí)接毒:將凍存于-80℃冰箱內(nèi)的HSV-2病毒迅速在37℃水浴鍋內(nèi)溶化；棄細(xì)胞瓶?jī)?nèi)原有的培養(yǎng)基,PBS清洗

10、一次；加溶化好的病毒液500μl,搖勻,5％CO2,37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)1.5 h,每隔15 min搖勻一次；1.5 h后棄病毒液,PBS清洗一次,加病毒維持液；將此板置于5％CO2,37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞CPE發(fā)展情況,待所有細(xì)胞都出現(xiàn)CPE時(shí),收集病毒。
　　 6.HSV-2病毒的收集與保存
　　 將要收毒的細(xì)胞瓶反復(fù)凍融三次(必須在-80℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融,因?yàn)榇瞬《静荒鼙２赜?20℃)； 反復(fù)凍融后,用移液器吹

11、打細(xì)胞,并將吹打完畢的細(xì)胞維持液,細(xì)胞一同轉(zhuǎn)置15ml離心管,低溫冷凍離心(4℃,4000 r/min,10 min)；將上清液轉(zhuǎn)入凍存管內(nèi),直接置于-80℃保存。
　　 7.HSV-2病毒滴度測(cè)定
　　 細(xì)胞準(zhǔn)備:Vero細(xì)胞以104/孔的濃度鋪96孔板,過(guò)夜后細(xì)胞基本長(zhǎng)滿細(xì)胞板時(shí)實(shí)驗(yàn)；病毒稀釋:用維持液將病毒10倍稀釋,第一個(gè)濃度為10-1倍原液,而后依次稀釋；棄細(xì)胞板中的原有培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,加50μl/孔的

12、維持液；將不同濃度的病毒稀釋液加入裝有維持液的細(xì)胞板內(nèi)(每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔),50μl/孔；同時(shí)設(shè)定細(xì)胞組對(duì)照。將此板置于5％CO2,37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞CPE的產(chǎn)生情況,72h后觀察見(jiàn)有CPE出現(xiàn)的孔均為陽(yáng)性；根據(jù)Reed-Munch公式計(jì)算 TCID50。
　　 8.HSV-2病毒抑制實(shí)驗(yàn)CPE肉眼觀察與MTT定量測(cè)定
　　 鋪Vero細(xì)胞到96孔板,104/孔,過(guò)夜培養(yǎng)；次日棄培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,每孔

13、加100個(gè) TCID50的HSV-2病毒,50μl/孔；加2倍稀釋的候選殺微生物劑(維持液稀釋),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,50μl/孔；同時(shí)設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照藥ACV組(阿昔洛韋,1μg/ml),維持液組,細(xì)胞組做對(duì)照。將此板置于5％CO237℃孵箱內(nèi)培養(yǎng),每日觀察CPE現(xiàn)象,在維持液組(純病毒組)的細(xì)胞100％CPE時(shí),記錄每孔CPE情況,肉眼觀察候選殺微生物劑對(duì)HSV-2的抑制作用。待維持液組的細(xì)胞完全懸浮死亡時(shí),記錄結(jié)果并進(jìn)行MTT測(cè)定:P

14、BS現(xiàn)配現(xiàn)用MTT溶液,5 mg/ml,避光:向上述板內(nèi)加入MTT溶液,10μl/孔,混勻,將細(xì)胞板置于5％CO2,37℃孵箱中培養(yǎng)4h；4h后離心(300 rcf,5 min),棄上清,加DMSO 100μl/孔,混勻后測(cè)定吸光度值(OD570)。
　　 9.HSV-2病毒抑制時(shí)效實(shí)驗(yàn)
　　 細(xì)胞準(zhǔn)備,病毒配置,對(duì)照組設(shè)置與上述HSV-2病毒抑制實(shí)驗(yàn)方法一致；向該細(xì)胞板內(nèi)加100 TCID50 HSV-2病毒,50μl

15、/孔,細(xì)胞組除外；細(xì)胞組與維持液組分別加入維持液100μl/孔和50μl/孔；分別在加入病毒后的0 h,0.5 h,1 h,2 h,4 h,8 h加入各對(duì)應(yīng)時(shí)間組的測(cè)定藥物,50μl/孔；加藥后培養(yǎng),觀察與MTT測(cè)定方法與上述HSV-2病毒抑制實(shí)驗(yàn)方法一致。
　　 10.細(xì)胞毒性測(cè)定
　　 鋪Vero細(xì)胞到96孔板,104/孔,過(guò)夜培養(yǎng)；次日棄培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,加50μl/孔維持液；用維持液將候選殺微生物劑稀釋成不

16、同濃度,50μl/孔,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)細(xì)胞組做對(duì)照。搖勻后,將細(xì)胞板置于5％CO2,37℃孵箱中培養(yǎng),72h后每孔加入5mg/ml MTT 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心(300rcf,5 min),棄上清,加DMSO 100μl/孔,混勻,測(cè)定吸光度值(OD570)。
　　 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 IC50和CC50的計(jì)算采用Calcusyn軟件；做圖依據(jù)的是GraphPad Prism 4.03(數(shù)據(jù)分析

17、和作圖軟件)；所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
　　 結(jié)論:
　　 1.我國(guó)女性陰道乳酸桿菌的優(yōu)勢(shì)菌種很可能也包括卷曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)和格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)。
　　 2.以生理特性與生化反應(yīng)為分析點(diǎn)的法國(guó)bioMérieux(生物梅里埃)公司研制的API 50 CHL鑒定條碼體系,在鑒定乳酸桿菌時(shí)存在漏洞,鑒定結(jié)果與

18、分子鑒定結(jié)果存在差異。
　　 3.酸酐修飾蛋白類候選殺微生物劑HP-OVA,ML-OVA和HP-HSA與小分子HIV進(jìn)入抑制劑90％TF和ADS-J1對(duì)陰道乳酸桿菌的體外生長(zhǎng)影響較小,為其成為殺微生物劑提供了部分安全性依據(jù)。
　　 4.酸酐修飾蛋白類候選殺微生物劑ML-OVA,HP-OVA和HP-HSA與小分子HIV進(jìn)入抑制劑類候選殺微生物劑中ADS-J1均具有明顯抑制HSV-2病毒作用,且對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用小,為