三個(gè)改造后的Bt抗蟲(chóng)基因在煙草中的殺蟲(chóng)活性研究.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera Hubner)屬于鱗翅目夜蛾科，在世界各地廣泛分布，是棉花生產(chǎn)最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一。20世紀(jì)80、90年代，棉鈴蟲(chóng)在全世界主要產(chǎn)棉區(qū)大面積暴發(fā)，導(dǎo)致棉花嚴(yán)重減產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)20多年的研究和生產(chǎn)應(yīng)用，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉取得了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。然而隨著抗蟲(chóng)棉的大面積種植，在高生態(tài)選擇壓作用下，棉鈴蟲(chóng)對(duì)抗蟲(chóng)基因產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增加。通過(guò)對(duì)Bt蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)單一Bt基

2、因棉花的大面積推廣應(yīng)用容易導(dǎo)致昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。因此，通過(guò)發(fā)掘不同殺蟲(chóng)機(jī)理的Bt基因，創(chuàng)制含有不同殺蟲(chóng)機(jī)理復(fù)合抗蟲(chóng)棉花新材料，已經(jīng)成為當(dāng)前抗蟲(chóng)棉花基因工程的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)復(fù)合抗蟲(chóng)基因棉花，不僅可以提高殺蟲(chóng)效率，而且可有效地避免或延遲昆蟲(chóng)的抗性發(fā)生。cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11是從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)中克隆到的3個(gè)新型Bt晶體蛋白殺蟲(chóng)基因。其中Cry2Ah2和Cry2Ab4是在

3、孢子形成期產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal crystalproteins，ICPs)，對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲(chóng)具有毒殺功能。Vip3Aa11是一種營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs），對(duì)棉鈴蟲(chóng)、小地老虎等一系列鱗翅目害蟲(chóng)均有較高的毒性作用。
　　本研究依據(jù)棉花遺傳密碼子偏好性，對(duì)cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化改造，

4、改造后的三個(gè)基因克隆到pGBI121植物表達(dá)載體，構(gòu)建成pGBI-cry2Ah2(35S∷cry2Ah2:Nos)、pGBI-cry2Ab4(35S∷cry2Ab4:Nos)和pGBI-vip3Aa11(35S∷vip3Aa11: Nos)單基因表達(dá)載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89（Nicotiana tabacum L.）后，分別獲得30株轉(zhuǎn)cry2Ah2基因陽(yáng)性煙草植株，33株轉(zhuǎn)cry2Ab4基因陽(yáng)性煙草植株，40株轉(zhuǎn)vip3Aa

5、11基因陽(yáng)性煙草植株。熒光定量PCR結(jié)果表明，三個(gè)抗蟲(chóng)基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株均能穩(wěn)定地高水平地表達(dá)外源抗蟲(chóng)基因，我們分別選取了表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，三個(gè)基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，其中轉(zhuǎn)cry2Ah2基因煙草進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平驗(yàn)證了其表達(dá)。生物活性檢測(cè)結(jié)果表明，用轉(zhuǎn)cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11基因煙草葉片分別飼喂初孵棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，4天后幼蟲(chóng)校正死亡率

6、分別在86.59％，86.51％和87.70％以上，均達(dá)到高抗水平，其中，轉(zhuǎn)vip3Aa11植株抗蟲(chóng)效果優(yōu)于轉(zhuǎn)cry2Ah2和cry2Ab4植株，轉(zhuǎn)cry2Ah2與cry2Ab4基因植株抗蟲(chóng)水平相當(dāng)。這一結(jié)果表明cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11三個(gè)基因?yàn)楝F(xiàn)有抗蟲(chóng)棉的深化研究提供了新的抗性基因源。
　　本研究證實(shí)了3個(gè)基因均可以在模式植物中高水平表達(dá)，并使轉(zhuǎn)基因煙草具有高抗蟲(chóng)性，是防治棉鈴蟲(chóng)等害蟲(chóng)的新型候選抗蟲(chóng)基因，