牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白間接ELISA的建立與應用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(IBR)，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。IBR被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類傳染病，也是我國進境動物和國際動物貿(mào)易中規(guī)定的重點檢疫對象。因此，加強IBR診斷技術(shù)的研究工作對預防和控制本病具有重要的現(xiàn)實意義。目前，國內(nèi)還沒有商品化的檢測IBR的診斷試劑，口岸動物IBR的檢測處于嚴重依賴國外試劑盒的狀況。 本研究用大腸桿菌表達了牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因，將重組

2、蛋白純化后作為包被抗原建立了檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法。gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染細胞的表面，是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是IBR診斷試劑中特異性抗原的首選蛋白。本實驗將IBRVgD基因的重組質(zhì)粒pET30a-gD轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌，經(jīng)IPTG誘導得到了大量可溶性表達的重組蛋白，采用Ni柱親和層析法在非變性的條件下成功地純化了重組蛋白，純化的重組蛋白濃度為0.128mg/ml，純度為96％

3、。Westernblot和間接ELISA檢測證明純化后的重組蛋白可以被牛傳染性鼻氣管炎病毒抗血清所識別，具有良好的反應原性。將大腸桿菌表達的牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白，純化后作為包被抗原建立了檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的間接ELISA診斷方法，將其命名為gD-ELISA。通過一系列試驗，確定了底物液中TMB最佳使用濃度(0.4mg/ml)；DMSO最佳使用濃度(15％)；0.75％過氧化氫尿素最佳使用濃度(25.6μl/ml);

4、重組抗原最佳包被濃度(6.4μg/ml)；最佳封閉液(含10％馬血清的PBST)和最佳封閉時間(1h)；血清樣本最佳稀釋度(1:80)和最佳作用時間(1.5h)；酶標二抗最佳工作濃度(1:5000)和最佳作用時間(1h)；底物最佳顯色時間(15min)和終止液最佳作用時間(5min)：判定臨界值(PR≥38.0為陽性，PR＜30.8為陰性)。交叉反應試驗表明，該重組抗原與其它常見5種牛病的陽性血清不發(fā)生交叉反應。阻斷試驗表明，IBRV細

5、胞培養(yǎng)液能在很大程度上阻斷重組抗原與陽性血清的反應，而對陰性血清沒有明顯的影響。重復性試驗表明，批內(nèi)重復的變異系數(shù)小于5％，批間重復的變異系數(shù)小于15％。與病毒中和試驗相比，符合率、敏感性和特異性分別為84.1％、85.0％和83.4％。與本實驗室已建立的IBRV全病毒ELISA診斷方法相比，符合率、敏感性和特異性分別為91.9％、94.2％和90.2％。應用IBRVgD-ELISA檢測了國內(nèi)11個省份的2012份血清樣本，得出國內(nèi)平均