ATP敏感性鉀通道(K-,ATP-)開放劑對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及PI3K-Akt-CREB信號(hào)通路的影響.pdf

1、前言
　　 缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病,目前尚無有效的治療方法,很多研究表明,在腦缺血急性期,如何有效挽救缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡對(duì)腦缺血患者的功能恢復(fù)非常重要。ATP敏感性鉀通道(KATP)開放劑可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和再生、對(duì)抗神經(jīng)元缺氧,是近年新興的一種腦保護(hù)劑,但其作用機(jī)制尚不完全清楚。近年來一個(gè)新的生長因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K(phosphatidy linositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激

2、酶)/AKT(v-akt murine thymoma viral oncogenehomolog,蛋白激酶B)逐漸被人們認(rèn)識(shí),研究表明它參與了許多細(xì)胞的抗凋亡、增殖、分化等,尤其對(duì)生長因子介導(dǎo)的神經(jīng)元存活有明顯的促進(jìn)作用。PI3K/Akt能直接或間接磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),發(fā)揮抗凋亡作用。本研究通過PCI2細(xì)胞培養(yǎng)方法,觀察KATP通道開放

3、劑對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡影響,及對(duì)缺血缺氧后PC12細(xì)胞p-Akt、p-CREB蛋白及mRNA的表達(dá)變化影響,探討KATP通道開放劑的腦保護(hù)作用機(jī)制,為KATP通道開放劑能盡早應(yīng)用于臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 目的
　　 觀察KATP通道開放劑對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡影響,并進(jìn)一步探討KATP通道開放劑保護(hù)缺血缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,明確KATP通道開放劑是否通過PI3K/A

4、KT/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡,為KATP通道開放劑能盡早應(yīng)用于臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 取傳代后3d的PC12細(xì)胞,分為A組(正常對(duì)照組)、B組(缺血缺氧對(duì)照組)、C組(吡那地爾處理組)、D組(吡那地爾+格列吡嗪處理組)共4組。C組在PC12細(xì)胞缺血缺氧誘導(dǎo)前20min加入濃度為100μmol.L-1的KATP通道開放劑吡那地爾；D組則在缺血缺氧誘導(dǎo)前20min加入濃度100

5、μmol.L-1的吡那地爾和濃度500μmol.L-1的KATP通道阻斷劑格列吡嗪,采用Annexin-v FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)凋亡率,應(yīng)用Western-blotting檢測(cè)p-Akt、p-CREB蛋白表達(dá)水平,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)AKt、CREB mRNA:表達(dá)水平,觀察KATP開放劑對(duì)缺血缺氧PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果
　　 B、C、D組細(xì)胞

6、凋亡率隨時(shí)間點(diǎn)增加而增加,24小時(shí)達(dá)高峰。以后隨時(shí)間延長,逐漸降低。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)B、C、D組細(xì)胞凋亡率均高于A組(P<0.05),C組和B、D組比較,細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05),B和D組比較無顯著性差異(P>0.05).
　　 2、蛋白免疫印跡結(jié)果
　　 B、C、D組隨時(shí)間延長p-Akt、p-CREB蛋白表達(dá)增加,12小時(shí)達(dá)高峰。以后逐漸減少。B、C、D組均高于對(duì)照組(P<0.05)。C組表達(dá)均高于B和D組(P<0.

7、05)。B和D組比較無差異(P>0.05)。
　　 3、半定量RT-PCR結(jié)果
　　 B、C、D組隨時(shí)間延長Akt、CREB mRNA表達(dá)增加,12小時(shí)達(dá)高峰。以后逐漸減少。B、C、D組均高于對(duì)照組(P<0.05)。C組表達(dá)均高于B和D組(P<0.05)。B和D組比較無差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 KATP通道開放劑吡那地爾能明顯降低缺血缺氧誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞凋亡,增加p-AKt,p-CREB