槲皮素金屬配合物抗腫瘤作用及其與DNA相互作用的機(jī)理研究.pdf

1、惡性腫瘤現(xiàn)已成為人類死亡的主要原因之一,尋找抗腫瘤藥物已經(jīng)成為藥學(xué)研究的重大課題。近年研究表明某些槲皮素金屬配合物不但抗氧化活性比槲皮素強(qiáng),而且其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用也比槲皮素強(qiáng)。然而目前槲皮素金屬配合物抗腫瘤的作用機(jī)制還不清楚。它們能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,作用靶點(diǎn)等科學(xué)問(wèn)題還有待探索研究。本課題利用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算化學(xué)等多學(xué)科交叉手段,主要研究了槲皮素金屬配合物(Mn、Co、Ni、Cu、Zn)對(duì)腫瘤細(xì)胞

2、凋亡的影響,及其與DNA結(jié)合和催化DNA斷裂作用,探討了槲皮素金屬配合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制及其與DNA相互作用的機(jī)理。得到了如下結(jié)論:①采用MTT法、熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性和誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究,初步探討了槲皮素金屬配合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。1)結(jié)果表明槲皮素金屬配合物(Mn、Co、Ni、Cu、Zn)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和肺腺癌細(xì)胞A549的生

3、長(zhǎng)均有明顯的抑制作用,并呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。其中槲皮素錳、鎳和鋅配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于配體槲皮素,它們作用于HepG2細(xì)胞48小時(shí)的半數(shù)抑制濃度IC50分別為20.64、14.44和10.67μmol·L-1,而槲皮素的IC50為33.69μmol·L-12)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明HepG2細(xì)胞經(jīng)槲皮素錳、鎳和鋅配合物處理后,染色質(zhì)凝聚,且有明顯的凋亡小體出現(xiàn),表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。3)細(xì)

4、胞周期分析結(jié)果表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能是通過(guò)使細(xì)胞阻滯于G0/G1期,使細(xì)胞DNA合成速度降低,細(xì)胞周期的循環(huán)被抑制而實(shí)現(xiàn)的。對(duì)G0/G1期細(xì)胞阻滯可能是配合物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。4)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡可能通過(guò)下調(diào)bcl-2和survivin,上調(diào)p53,引發(fā)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而激活caspase-3來(lái)進(jìn)行的。下調(diào)sur

5、vivin和bcl-2的表達(dá)對(duì)槲皮素金屬配合物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡既起到了協(xié)同作用,又起到了互補(bǔ)作用。②采用紫外光譜法、熒光光譜法和粘度法研究了槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物與小牛胸腺DNA的結(jié)合方式,采用凝膠電泳法、脫水丙二醛分析和T4連接實(shí)驗(yàn)較系統(tǒng)地研究了槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物對(duì)質(zhì)粒pBR322DNA的催化斷裂情況。初步探討了槲皮素金屬配合物和DNA的作用方式及其對(duì)DNA的催化斷裂機(jī)理。發(fā)現(xiàn)槲皮素金屬配合物具有核酸酶類活性

6、。1)槲皮素錳、鈷、鎳和鋅配合物僅以插入方式與DNA結(jié)合,而槲皮素銅配合物與DNA的結(jié)合方式可能不止一種,除插入方式結(jié)合以外還受到靜電作用的影響。2)槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物均能有效斷裂DNA,且槲皮素銅配合物斷裂DNA的能力最強(qiáng);對(duì)于槲皮素錳、鎳、銅和鋅配合物,低離子強(qiáng)度促進(jìn)DNA裂解,高離子強(qiáng)度抑制DNA裂解;離子強(qiáng)度增大能促進(jìn)槲皮素鈷配合物對(duì)DNA的斷裂,所以槲皮素金屬配合物對(duì)DNA的斷裂作用受離子強(qiáng)度的影響。3)如以超螺旋

7、DNA為底物,槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物催化斷裂DNA的反應(yīng)符合準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)速率定律。其速率常數(shù)分別為1.18×10-4s-1、0.53×10-4s-1、0.76×10-4s-1、4.82×10-4s-1、1.68×10-4s-1。4)DNA斷裂機(jī)理實(shí)驗(yàn)表明槲皮素錳、鈷、鎳和鋅配合物均能以水解途徑斷裂DNA;槲皮素銅配合物以氧化還原途徑斷裂DNA,可能與Cu(I)OOH物質(zhì)有關(guān)。③引入量子化學(xué)和分子力學(xué)方法,對(duì)槲皮素金屬配合物抗腫瘤作

8、用的機(jī)制及其與DNA結(jié)合作用的機(jī)理進(jìn)行了理論解釋。1)對(duì)槲皮素金屬配合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了量子化學(xué)計(jì)算,通過(guò)對(duì)其幾何構(gòu)型的討論,發(fā)現(xiàn)槲皮素金屬配合物的6個(gè)配位氧原子與金屬離子形成畸形六配位八面體配合物,其配位結(jié)構(gòu)是合理的;根據(jù)NBO電荷分析、前沿分子軌道分析解釋了配合物的配位特性,發(fā)現(xiàn)羥基氧的配位能力強(qiáng)于羰基氧。2)計(jì)算結(jié)果表明槲皮素金屬配合物的LUMO及附近未占軌道能量比DNA堿基對(duì)模型CG/GC的HOMO和NHOMO的能量低,有利于配合物接

9、受DNA堿基對(duì)上的電子,增強(qiáng)了配合物與DNA堿基對(duì)的π-π相互作用。槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性及其DNA鍵合能力與其LUMO的能量和配體所帶電荷兩方面的因素有關(guān)。3)運(yùn)用分子力學(xué)研究了配合物插入DNA的過(guò)程,結(jié)果表明五種槲皮素金屬配合物都可以插入到DNA堿基對(duì)之間,傾向于從小溝插入到CG/GC堿基對(duì)間。根據(jù)槲皮素金屬配合物插入DNA堿基對(duì)后的勢(shì)能值,發(fā)現(xiàn)配合物與DNA插入能力的理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。槲皮素金屬配合物與DNA結(jié)合作用