脂肪干細(xì)胞移植治療腦冷凍損傷的實驗研究.pdf

1、在現(xiàn)代社會里，由于工業(yè)與交通的快速發(fā)展，急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)生率幾乎呈直線上升；然而一方面雖然現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)日益發(fā)展，高精尖設(shè)備業(yè)已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的診斷與治療，但另一方面不可否認(rèn)的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的致殘率與死亡率卻始終居高不下。面對這一棘手而現(xiàn)實的矛盾，世界各國均投入大量的人力、財力來研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)這一神經(jīng)科學(xué)的重大難題，其間干細(xì)胞(Stern cells)的發(fā)現(xiàn)和研究給這類疾病帶來了希望的曙光，但目前關(guān)于干細(xì)胞的研究

2、還主要停留在實驗室階段，而干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床應(yīng)用領(lǐng)域的研究則甚少，僅有關(guān)于神經(jīng)退行性變的研究暫時處于領(lǐng)先地位，例如胚胎干細(xì)胞治療帕金森病的研究工作也已經(jīng)進(jìn)入臨床階段。 我們知道，中樞神經(jīng)損傷后，由于神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)突觸連接斷裂以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，加上內(nèi)源性的修復(fù)系統(tǒng)傾向于形成膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕修復(fù)，因此難以形成有效的神經(jīng)功能修復(fù)從而影響疾病的預(yù)后。雖然干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷已經(jīng)成為一種趨勢，但是由于多種原因目前這方面的工作進(jìn)展

3、還是比較緩慢，比如取材困難和倫理問題都限制著對干細(xì)胞的研究。然而近年來，脂肪干細(xì)胞(Adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)已逐漸成為干細(xì)胞研究的一個新的趨向，因為這種干細(xì)胞來源于成脂細(xì)胞，具有取材容易，并可以向脂肪、骨、軟骨、平滑肌、心肌、內(nèi)皮、肝臟以及神經(jīng)等多種組織分化的優(yōu)點，因此為干細(xì)胞的研究和應(yīng)用打開了一扇大門，本實驗就是建立在觀察移植脂肪干細(xì)胞治療腦冷凍損傷前后相關(guān)指標(biāo)變化的基礎(chǔ)上，希望

4、能為脂肪干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 本實驗的內(nèi)容包括：體外提取培養(yǎng)和純化ADSCs，檢測ADSCs的相關(guān)分子標(biāo)記物，觀察ADSCs的分化能力，并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元的方向分化。另外還要制作實驗大鼠的腦冷凍傷模型，最后觀察移植ADSCs后其對冷凍傷腦組織的保護(hù)情況以及對細(xì)胞凋亡的抑制情況和對損傷后神經(jīng)功能障礙帶來的改善并且研究這些過程形成的原因。本次實驗分為兩部分： 一 ADSCs的培養(yǎng)以及向神經(jīng)元方向的定向

5、分化 目的：從大鼠脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，體外培養(yǎng)觀察其形態(tài)、生長方式以及表面標(biāo)志物表達(dá)等生物學(xué)特征。誘導(dǎo)ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，觀察其形態(tài)學(xué)特征和特異標(biāo)志物的表達(dá)。 方法：無菌條件下取SD大鼠的腹股溝和腹膜后脂肪，用機(jī)械分離和膠原酶消化結(jié)合的方法分離出ADSCs，并接種于15％FBSDMEM low Glucose培基中。進(jìn)行純化和傳代，相差顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)。取第五代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞技

6、術(shù)檢測抗原標(biāo)志物CD29、CD34、CD44。通過兩步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，免疫熒光法檢測NSE、GFAP抗原的表達(dá)情況。低溫凍存脂肪干細(xì)胞，并復(fù)蘇傳代。 結(jié)果：從大鼠的脂肪組織中可分離培養(yǎng)ADSCs，呈貼壁式生長，貼壁速度快，為梭形細(xì)胞形態(tài)，在含血清培養(yǎng)中能夠連續(xù)傳代并穩(wěn)定增殖。流式細(xì)胞技術(shù)檢測顯示這種脂肪來源的細(xì)胞CD34表達(dá)為陰性，CD29和CD44表達(dá)率在90％以上。經(jīng)含bFGF和β-巰基乙醇的培養(yǎng)基聯(lián)

7、合誘導(dǎo)后，ADSCs可分化為強(qiáng)烈表達(dá)NSE的神經(jīng)元樣細(xì)胞，而未見星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表面標(biāo)志GFAP的表達(dá)。凍存和復(fù)蘇后的ADSCs仍然能穩(wěn)定傳代并被誘導(dǎo)向神經(jīng)元方向分化。 結(jié)論：1.大鼠的脂肪組織類可以分離出具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力的細(xì)胞，這類細(xì)胞表達(dá)CD44、CD29等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.脂肪來源的干細(xì)胞可以穩(wěn)定的傳代，經(jīng)過神經(jīng)方向誘導(dǎo)技術(shù)的誘導(dǎo)，這類細(xì)胞可以分化為表達(dá)NSE抗原的神經(jīng)元樣細(xì)胞。3.脂肪干細(xì)胞可以被凍存和復(fù)

8、蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞仍然可以穩(wěn)定傳代。 二脂肪干細(xì)胞移植治療腦冷凍傷動物模型 目的：觀察脂肪干細(xì)胞移植進(jìn)入腦凍傷大鼠腦內(nèi)后對動物的影響，研究脂肪干細(xì)胞移植做為一種新的手段治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性。 方法：體外培養(yǎng)并傳代純化的SD大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，用BrdU標(biāo)記過夜備用。用液氮硬膜外冷凍法制作大鼠的腦冷凍傷模型，將大鼠分為實驗組(腦冷凍傷后12，14小時腦內(nèi)移植Brdu標(biāo)記的ADSCs)動物數(shù)量25只，對照組

9、(腦冷凍傷后12，24小時移植DMEM培基)動物數(shù)量25和假手術(shù)組(僅行顱骨開窗手術(shù))動物數(shù)量5只。分別在移植細(xì)胞后1，3，7，14,30天各個時間點對實驗動物進(jìn)行NSS神經(jīng)功能評分，處死實驗大鼠，制作腦組織切片，行免疫熒光染色檢測BrdU陽性細(xì)胞。行Tunel染色檢測凋亡細(xì)胞，腦組織RT-PCR檢測VEGF、BDNF等因子mRNA表達(dá)，Western blot檢測VEGF、BDNF蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素方差分析，統(tǒng)計學(xué)軟件采

10、用SPSS11.0軟件包完成。 結(jié)果：在移植了ADSCs后，免疫熒光學(xué)方法可以檢測到Brdu標(biāo)記的ADSCs在實驗組大鼠腦組織內(nèi)分布并且向病灶中心位置遷移，并且可以檢測到Brdu和Nse雙標(biāo)陽性的細(xì)胞。實驗組大鼠在3,7天兩時間點同對照組相比NSS評分有顯著差異(P<0.05)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示實驗組大鼠腦組織中BDNF表達(dá)在1-14天表達(dá)比對照組更高(P<0.05)而VEGF表達(dá)實驗組在所有時間點都高于對照組(P<0.

11、05)，Western blot檢測實驗組的BDNF蛋白水平在1-14天與對照組相比明顯的升高(P<0.05)而VEGF蛋白在所有時間點都表達(dá)升高，并且通過Tunel凋亡檢測發(fā)現(xiàn)移植ADSCs后所有時間點實驗組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞比對照組明顯減少(P<0.05)。 結(jié)論：1.成功制作大鼠腦冷凍傷動物模型，模擬了腦水腫和繼發(fā)性腦損傷。2.脂肪干細(xì)胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存活，遷移并分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 3.它可以引起VEGF、BDNF