兔脂肪干細胞聯(lián)合富血小板血漿對脂肪移植成活率的影響.pdf

1、背景：自體脂肪移植因具有來源充足、獲取方便、對機體損傷小、無排異反應(yīng)并可長期存活于填充部位等優(yōu)點，已被整形美容外科廣泛應(yīng)用于軟組織填充與重建，但脂肪移植后不確定的高吸收率及液化、壞死、鈣化等缺陷逐漸顯現(xiàn)出來，限制了進一步的發(fā)展應(yīng)用。富血小板血漿（Platelet-rich plasma,PRP）是將自體血通過梯度離心得到的血小板濃縮物,其血小板被激活后可釋放多種生長因子。很多研究已經(jīng)證實富血小板血漿中的生長因子對軟組織損傷修復(fù)、骨組織生

2、長等有促進作用,并可以促進脂肪干細胞的增殖及移植脂肪周圍血管化的生成，減少移植脂肪組織炎性反應(yīng)，從而提高其存活率。脂肪來源的成體干細胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，可誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞、成骨細胞、神經(jīng)、造血細胞等，且組織相容性好、低免疫原性，做為良好的種子細胞大量應(yīng)用于組織工程研究。研究證明脂肪組織中富含的干細胞群其較強的更新能力使脂肪細胞得到不斷的更新，因此國內(nèi)

3、外學(xué)者就如何促進脂肪組織中干細胞增殖分化以提高移植脂肪存活率做了大量研究。
　　目的：通過建立動物模型,將提取的兔 ADSCs及富血小板血漿與自體脂肪組織一同植入裸鼠皮下,于不同時間段取出，從移植物的大體外觀、組織學(xué)等方面觀察PRP聯(lián)合ADSCs對脂肪移植物成活的影響，從而為提高脂肪移植成活率的臨床研究提供實驗依據(jù)。
　　方法：⑴從新西蘭大白兔背部取出脂肪組織，用改良I型膠原酶消化法體外提取ADSCs，傳代培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特

4、征。⑵流式細胞儀測定其表面標志物，成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后進行油紅 O及茜素紅染色，鑒定其符合ADSCs的生物學(xué)特性。⑶Appel法提取兔富血小板血漿并進行血小板計數(shù)。⑷MTT法測定實驗組（ADSCs+PRP）、對照組（ADSCs+PBS）及空白組（完全培養(yǎng)基+PBS）不同時間段對兔脂肪干細胞增殖的影響。⑸獲取并處理脂肪顆粒。15只裸鼠隨機編號分組，分為3組，每組5只。于裸鼠背部取4點，體內(nèi)分4組：①脂肪顆粒0.1ml+PBS0.1ml②脂

5、肪顆粒0.1ml+ADSCs0.05ml+PBS0.05ml③脂肪顆粒0.1ml+PRP0.05ml+PBS0.05ml④脂肪顆粒0.1ml+ADSCs0.05ml+PRP0.05ml。將各組移植物植入裸鼠皮下。⑹不同時間點（7d、14d、30d）取出，大體觀察新生組織塊，HE染色及免疫組化處理，觀察組織形態(tài)，計算空泡及壞死面積及微血管數(shù)。結(jié)果行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：①ADSCs原代培養(yǎng)4h左右開始貼壁，細胞大小不等，24h部分

6、貼壁，細胞呈多角形、類圓形，培養(yǎng)基中見未貼壁的紅細胞及筋膜雜質(zhì)，48h半量換液貼壁細胞呈三角形、短梭形生長。前3d細胞處于潛伏期，生長緩慢，之后細胞增殖迅速，6d左右可達80％融合，細胞呈長梭樣，并呈現(xiàn)漩渦狀、集落狀生長。對此進行消化傳代，細胞4-6h可大部分貼壁。第2代尚見少量細胞呈多角形，漩渦樣、成纖維樣生長明顯，傳至3代至以后時，細胞增殖速度明顯加快，細胞呈成纖維樣、魚群樣穩(wěn)定生長，傳至10代細胞形態(tài)無明顯改變。利用流式細胞儀對細

7、胞表面標記物進行測定，陽性表達 CD29、CD44，陰性表達 CD45、CD34，成脂、成骨誘導(dǎo)分化后油紅O及茜素紅染色結(jié)果均為陽性，對照組呈陰性。②全血血小板計數(shù)結(jié)果：PRP血小板計數(shù)是全血的4.34倍。③細胞增殖實驗MTT法顯示PRP組在24h、48h、72h時對ADSCs的增殖較對照組增殖明顯，與空白組有統(tǒng)計學(xué)差異(＜0.05)。④各時間段內(nèi)脂肪顆粒+ADSCs+PRP組空泡及壞死面積低于其他組（P＜0.05），移植脂肪存活率較高