重組人腫瘤壞死因子α影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性及表達(dá)PD-L1蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使冠脈血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的疾病，是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見(jiàn)類型，發(fā)病率在我國(guó)呈逐年攀升趨勢(shì)，是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病。本病由多種原因綜合所致，與年齡、性別、血壓、血脂、血糖、遺傳等多種因素相關(guān)，因此，本病病因及發(fā)病機(jī)制成為近幾十年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。早期研究中，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(C

2、HD)的主要發(fā)病原因，病變特征是血中脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，引起內(nèi)膜局灶性纖維性增厚及其深部成分的壞死、崩解，形成粥樣物，所以早期研究者認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是因脂質(zhì)沉淀于血管內(nèi)皮所致，即傳統(tǒng)的脂質(zhì)沉淀理論。血脂增高被認(rèn)為是冠心病的重要高危因素，但統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)僅有約50％的冠心病患者表現(xiàn)為血脂增高。進(jìn)一步研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化不僅是一種單純的脂肪沉積疾病，機(jī)體的慢性炎癥機(jī)制在粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。上世紀(jì)九十年代Dr.Russell

3、Ross首次提出了“損傷反應(yīng)”理論，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是多種損傷因素導(dǎo)致的發(fā)生在血管內(nèi)膜的慢性炎癥反應(yīng)，該理論使得人們對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了質(zhì)的提高。Dr.Russell Ross認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊形成始于一系列機(jī)械學(xué)和生化學(xué)刺激引起的功能性或者形態(tài)學(xué)內(nèi)皮損傷，細(xì)胞粘附分子表達(dá)增加，合成細(xì)胞因子如白介素-8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)等，單核及巨噬細(xì)胞隨后被激活并聚集在動(dòng)脈壁，接下來(lái)，脂肪積聚、生長(zhǎng)因子

4、和細(xì)胞因子進(jìn)一步釋放以及平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活增生。伴隨著這些過(guò)程的繼續(xù)，粥樣斑塊逐漸成長(zhǎng)和成熟。當(dāng)富含脂肪的細(xì)胞死亡，便形成斑塊的核心部分，導(dǎo)致斑塊重構(gòu)和纖維化或者最終破裂，血小板在內(nèi)皮細(xì)胞破損處聚集，形成血栓，常常導(dǎo)致急性冠脈綜合征。總之，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板以及這些細(xì)胞釋放的各種因子（如細(xì)胞素、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子和氧自由基等）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，促進(jìn)了AS的發(fā)展、惡化。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈

5、粥樣硬化過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，并與疾病預(yù)后有關(guān)。
　　 研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)非?；钴S，有大量的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，活動(dòng)性炎癥反應(yīng)亦可促使穩(wěn)定性粥樣斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定性斑塊，這是冠狀動(dòng)脈內(nèi)急性血栓形成的誘因。因此我們認(rèn)為，阻斷血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)或許可以成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的預(yù)防和治療途徑。
　　 程序性死亡因子配體1(programmed cell death liga

6、nd1，PD-L1、B7-H1或CD274)是由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白。最初因?yàn)楸话l(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，人們推測(cè)其與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)除腫瘤細(xì)胞以外，PD-L1在多種組織細(xì)胞和炎癥細(xì)胞上均有表達(dá)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、星形細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓源性肥大細(xì)胞、胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等;PD-L1的功能除與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)以外，也與多種病理過(guò)程有著密切的關(guān)系，如移植免疫反應(yīng)、自

7、身免疫性疾病、微生物感染等。近年來(lái)多項(xiàng)研究認(rèn)為，PD-L1作為B7家族分子的成員，其受體為程序性死亡因子1(programmed cell death1 receptor，PD-1或CD279)。PD-1的胞漿區(qū)尾部有2個(gè)酪氨酸殘基，N端酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，C端酪氨酸殘基則參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序

8、(immunoreceptor tyrosine-based switch motif,ITSM)，其中ITSM高度保守，提示其具有重要功能。研究表明，當(dāng)PD-1與其配體結(jié)合時(shí)，ITSM發(fā)生磷酸化，通過(guò)一系列的生化過(guò)程使下游的效應(yīng)分子去磷酸化，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PD-L1是PD-1的配體之一，與PD-1結(jié)合后發(fā)揮免疫調(diào)控作用。相關(guān)研究表明，PD-1/PD-L1信號(hào)系統(tǒng)對(duì)免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)作用，與動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥機(jī)制同樣相關(guān)。Gotsm

9、an等研究冠狀動(dòng)脈斑塊時(shí)，發(fā)現(xiàn)用熒光免疫技術(shù)可以探測(cè)到PD-L1表達(dá)于多處動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)。從PD-L1、PD-L2、LDL受體三種基因均敲除(triple knockout，TKO)小鼠體內(nèi)分離的APC能更強(qiáng)的刺激T細(xì)胞對(duì)ox-LDL的炎癥反應(yīng)，與LDL受體敲除的小鼠相比，TKO小鼠主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈的AS損傷區(qū)域增加了3倍。Lee等研究者發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血T淋巴細(xì)胞PD-1表型及樹(shù)突狀細(xì)胞PD-L1表型均較健康人的明顯降低。本課題組

10、的前期研究表明，穩(wěn)定性心絞痛及急性冠脈綜合癥患者外周血T淋巴細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增加，由此推測(cè)PD-L1可能在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 目前為止，細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白以及PD-L1蛋白發(fā)揮免疫調(diào)控作用的完整機(jī)制仍未完全清晰，不同研究對(duì)象及使用不同刺激物，得出結(jié)果不盡相同，歸納起來(lái)，影響PD-L1表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路可能為JAK/STAT信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、MEK/Erk

11、信號(hào)通路、NPM/ALK通路、MAPK通路等，并且與IRF-1和STAT-3轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。p38MAPK信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支，它通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá)，參與多種細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過(guò)程，能對(duì)廣泛的細(xì)胞外信號(hào)發(fā)生反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及死亡的全過(guò)程。本課題組前期研究結(jié)果表明，p38MAPK通路參與了樹(shù)突狀細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的調(diào)控過(guò)程，但是對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程啟動(dòng)并發(fā)展至關(guān)重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞，尚無(wú)相關(guān)研究

12、。鑒于此，本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，利用炎癥因子TNF-α刺激模擬炎癥過(guò)程，觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1的變化，首先明確TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的影響;再以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK通路，重復(fù)TNF-α刺激，觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系，探討TNF-α誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白的細(xì)胞分子機(jī)制，研究負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)系統(tǒng)(PD-

13、1/PD-L)調(diào)控慢性炎癥過(guò)程的機(jī)理，為動(dòng)脈粥樣硬化的免疫機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分 TNF-α刺激導(dǎo)致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降
　　 目的：觀察不同濃度的TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，篩選出對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有效且組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的TNF-α濃度梯度。
　　 對(duì)象和方法：
　　 1.對(duì)象體外培養(yǎng)的健康人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內(nèi)

14、皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 無(wú)菌條件下取新生兒臍帶約25厘米（中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，產(chǎn)婦知情同意，過(guò)程符合赫爾辛基宣言中的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)），剪去兩端夾痕，擠出臍帶內(nèi)殘留血液，PBS反復(fù)沖洗至沖洗液無(wú)色。夾緊血管下端，從上端注入0.1％膠原酶Ⅰ與含EDTA的胰蛋白酶(0.125％)消化獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，PBS離心沖洗兩遍洗去胰蛋白酶，用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO

15、2)培養(yǎng)，每12小時(shí)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁狀況，每48小時(shí)全量換培養(yǎng)基。約72小時(shí)后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，單層均勻排布，呈典型鋪路石樣。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗，胰蛋白酶消化，收獲細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。試驗(yàn)所用細(xì)胞為第3-5代，內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用Ⅷ因子相關(guān)抗原熒光染色。
　　 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基成分(每100ml培養(yǎng)基含:FBS20ml(20％) fromGibicol; Beta-ECGF5ng/ml from sigma; L-

16、glutamine,1 mM; Penicillin-Streptomycin; heparin2500U/100ml; M-19980ml from Gibicol。)
　　 2.2臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凍存?zhèn)溆?br>　　 至第3代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄去上層培養(yǎng)基，貼壁的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS輕柔沖洗2次以除去培養(yǎng)基成分，在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入含EDTA的濃度為0.125％胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，待細(xì)

17、胞由梭形回縮至球形時(shí)加入血清終止消化，PBS再次沖洗兩遍，加入成分為20％FBS、10ng/mLβ-ECGF、25U/mL肝素的M199培養(yǎng)基3ml，反復(fù)吹打至臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫離瓶壁懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/ml，吸取3ml用于細(xì)胞鑒定及Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞活性檢測(cè)試驗(yàn)，其余細(xì)胞經(jīng)1000轉(zhuǎn)/min、5min離心后，棄去上層培養(yǎng)基，加凍存液凍存于液氮中備用。凍存液配制:85％M199培養(yǎng)

18、基、10％胎牛血清、5％DMSO。
　　 2.3分組及CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　 將濃度為105個(gè)/ml的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（第3代）置于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，按照1∶3傳至第4代，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗、胰蛋白酶消化、吹打收集細(xì)胞，加入HUVECs專用培養(yǎng)基重懸，再次調(diào)整濃度為105個(gè)/ml。按照8組、每組5復(fù)孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，編號(hào)為1，2，3，4，5，6，7，8組。另設(shè)一

19、本底組編號(hào)為0，只加100μl全培養(yǎng)基，不含臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)本底值。共9組，45復(fù)孔。為減少試劑蒸發(fā)所致誤差，96孔板邊緣培養(yǎng)孔棄用并加PBS溶液填充。完畢后，將96孔板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，預(yù)培養(yǎng)后加入HUVECs專用培養(yǎng)基、含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基，調(diào)整每孔總?cè)萘恐?00μl。其中，1-8組含腫瘤壞死因子濃度分別為0ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,20 ng/ml,40 ng/m

20、l,60 ng/ml,80 ng/ml,100 ng/ml，0組加專用培養(yǎng)基至200μL，不含臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤壞死因子。繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5％CO2)48小時(shí)后加入Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑，每孔10μl，恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時(shí)后酶標(biāo)儀下檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD值）。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)

21、±S）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 顯微鏡下觀察，原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，形態(tài)為卵圓形，邊界清楚，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核呈橢圓形。培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞鋪滿板底，呈梭形，邊界清楚，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核呈橢圓形，單層排列，分布均勻，貼壁生長(zhǎng)，呈典型鋪路石樣。
　　

22、 2.Ⅷ因子相關(guān)抗原熒光染色
　　 熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，胞核為藍(lán)色，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的第Ⅷ因子相關(guān)抗原存在，對(duì)照組為陰性反應(yīng)。
　　 3.CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果
　　 從組1到組7，隨TNF-α濃度逐漸升高，各組細(xì)胞在450nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD value)逐漸降低(P＜0.05)，從（0.721±0.0129）降至（0.548±0.0196），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但

23、組7與組8之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，我們認(rèn)為可能與濃度梯度過(guò)小有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性可產(chǎn)生明顯影響，5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，80 ng/ml、100ng/ml組間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.擬選取0 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml

24、、80 ng/ml濃度分組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的影響
　　 目的:采用不同濃度TNF-α持續(xù)刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，Western Blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)。探討TNF-α對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的影響。
　　 對(duì)象和方法：
　　 1.對(duì)象體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內(nèi)皮

25、細(xì)胞解凍培養(yǎng)。將凍存于液氮中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（3代）取出，迅速置于37℃恒溫水浴鍋中，約1-2分鐘后完全融化，將含有細(xì)胞的凍存液移至離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心，吸去上層凍存液，加入HUVECs專用培養(yǎng)基，反復(fù)混合均勻，移入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每12小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，每48小時(shí)全量換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照1∶4傳代。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組及腫瘤壞死因子干預(yù)。待4代細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換液加入含有腫瘤壞死

26、因子的專用培養(yǎng)基，調(diào)整腫瘤壞死因子濃度分別為A組0ng/ml、B組5 ng/ml、C組20 ng/ml、D組80 ng/ml。恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)，棄去上層培養(yǎng)基，PBS反復(fù)沖洗2遍，含EDTA的胰蛋白酶消化，加入PBS溶液反復(fù)吹打細(xì)胞至脫落懸浮，離心收獲各組細(xì)胞，PBS反復(fù)離心沖洗2遍，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過(guò)夜。封閉完畢后PBST洗膜5次，加一抗，37℃反

27、應(yīng)1.5h，PBS洗膜5次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃反應(yīng)1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，QuantityOne Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步試驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩

28、比較采用LSD-t法，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.解凍后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，單層排布，呈典型鋪路石樣。細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核呈橢圓形。
　　 2.隨TNF-α濃度逐漸升高，A、B、C、D四組細(xì)胞的PD-L1蛋白表達(dá)逐漸下降(P＜0.05)，Western blot曝光顯色灰度比值分別為A組（1.797±0.1550），B組（1.512±0.1022），C組（1.108±

29、0.0799），D組（0.845±0.0542），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 腫瘤壞死因子α可明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白。抑制強(qiáng)度與TNF-α濃度正相關(guān)。
　　 第三部分 TNF-α通過(guò)p38MAPK通路調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1
　　 目的：以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK信號(hào)通路后，觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞受TNF-α刺激后PD-L1表達(dá)變

30、化，探討臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與p38MAPK信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 對(duì)象和方法：
　　 1.對(duì)象體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.方法
　　 2.1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍和培養(yǎng)。
　　 將凍存于液氮中的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（3代）取出，迅速置于37℃恒溫水浴鍋中，約1-2分鐘后全部融化，將含有細(xì)胞的凍存液移至離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分、5分鐘離心，棄去上層凍存液，加入HUVECs專用培養(yǎng)基，反復(fù)

31、混合均勻，種植于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。每12小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，每48小時(shí)全量換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照1∶3傳至第4代。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組
　　 將第4代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)3組，每組2復(fù)孔。根據(jù)是否使用TNF-α和p38MAPK通路抑制劑SB203580將實(shí)驗(yàn)分成三組，TNF-α濃度選擇80ng/ml，SB203580用二甲基亞砜(DMSO)溶解。
　　 第一組為正常培養(yǎng)組:使用專

32、用培養(yǎng)基孵育臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48小時(shí)作為空白對(duì)照;
　　 第二組為TNF-α干預(yù)組:使用專用培養(yǎng)基和配制好的含TNF-α濃度為2μg/ml的培養(yǎng)基，調(diào)整TNF-α濃度為80 ng/ml，溫箱中培養(yǎng)48小時(shí);
　　 第三組為TNF-α和SB203580共同干預(yù)組:加入DMSO溶解的p38MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理1小時(shí)，然后加入含TNF-α的培養(yǎng)基，調(diào)整TNF-α濃度為80 ng/ml，置于溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。

33、r>　　 2.3 Western blot方法檢測(cè)PD-L1蛋白
　　 收獲各組細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過(guò)夜。封閉完畢后PBST沈膜5次，加一抗，37℃反應(yīng)1.5h，PBS沈膜5次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃反應(yīng)1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，QuantityOne Basic軟

34、件分析膠片中蛋白條帶。本步實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.TNF-α干預(yù)組較正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預(yù)組表達(dá)PD-L1明顯下降，依次分別

35、為（0.486±0.0571）、（1.069±0.0401）、(1.215±0.0506)，P＜0.05，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常培養(yǎng)組、TNF-α和SB203580共同干預(yù)組表達(dá)PD-L1差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，正常培養(yǎng)組低于TNF-α和SB203580共同干預(yù)組。
　　 結(jié)論：
　　 1.p38MAPK通路參與了TNF-α影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化表達(dá)PD-L1蛋白的過(guò)程。
　　 2.正常培養(yǎng)組PD-L1蛋白表達(dá)