Exendin-4對(duì)不同熱缺血時(shí)間心死亡供體大鼠胰島功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 胰島移植是治療糖尿病的理想手段,而胰島細(xì)胞分離、純化的數(shù)量及質(zhì)量成為胰島移植成功的關(guān)鍵所在。影響因素包括移植早期供胰島缺血缺氧損傷、氧化應(yīng)激,胰島入血后即刻發(fā)生的血液介導(dǎo)的炎性反應(yīng)以及免疫攻擊等。其中,缺血時(shí)間一直被認(rèn)為是最重要的因素之一。眾多研究普遍認(rèn)為,熱缺血時(shí)間超過(guò)30分鐘,對(duì)大鼠胰島分離純化可產(chǎn)生明顯影響,不宜用于胰島移植。本實(shí)驗(yàn)研究在體外應(yīng)用Exendin-4與熱缺血胰島細(xì)胞培養(yǎng),觀察Exendin-4是

2、否能夠減少熱缺血誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖,改善胰島功能,針對(duì)胰島移植早期缺血的邊緣供體如何處理提供有效方法。
　　 材料與方法：
　　 一、材料；
　　 普通級(jí)封閉群Wistar大鼠,雌雄,體重250-280g。鼠顯微手術(shù)器械,超凈手術(shù)臺(tái),0.22um除菌濾器,電熱恒溫水浴箱(DHW-600),多功能振蕩器,電子天平,微量加樣器,熒光倒置顯微鏡(Olympus),高速離心機(jī)(TDL-5A),CO2

3、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。膠原酶V型,Hank's液,Ficoll-400,丫啶橙(AO),溴乙啶(EB);RPMI-1640培養(yǎng)液,Exendin-4。
　　 二、方法：
　　 (一)大鼠熱缺血模型的建立。
　　 大鼠秤重后,腹腔注射麻醉。腹部正中切口進(jìn)腹。剪開(kāi)膈肌,用血管鉗夾閉心臟基底部致使心臟停搏,阻斷胸主動(dòng)脈,造成心死亡供體(DCD)的熱缺血模型。
　　 (二)大鼠胰島的分離和純化。
　　

4、 采用明尼蘇達(dá)大學(xué)改良法分離、純化大鼠胰島。膠原酶V原位灌注胰腺,快速切取,水浴消化。再經(jīng)80目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾、離心。然后采用Ficoll不連續(xù)密度梯度離心純化胰島。
　　 (三)胰島培養(yǎng)及分組。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件隨機(jī)分為三組(n=6):第一組熱缺血0分鐘組:對(duì)照組(熱缺血0分鐘胰島細(xì)胞培養(yǎng)24h);實(shí)驗(yàn)組(10nmol/Lex-4與熱缺血0分鐘胰島細(xì)胞培養(yǎng)24h);第二組熱缺血30分鐘組:對(duì)照組(熱缺血30分鐘胰島

5、細(xì)胞培養(yǎng)24h);實(shí)驗(yàn)組(10nmol/LEx-4與熱缺血30分鐘胰島細(xì)胞培養(yǎng)24h);第三組熱缺血45分鐘組:對(duì)照組(熱缺血45分鐘胰島細(xì)胞培養(yǎng)24h);實(shí)驗(yàn)組(10nmol/LEx-4與熱缺血45分鐘胰島細(xì)胞培養(yǎng)24h)。在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)條件為:37℃,5％二氧化碳,95％空氣。
　　 三、觀察指標(biāo)；
　　 應(yīng)用雙硫蹤(DTZ)染色來(lái)計(jì)算分離胰島數(shù)目并判斷所提胰島的純度;丫啶橙/嗅乙啶

6、(AO/EB)熒光染色法顯示胰島細(xì)胞活率;體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用方差分析和t檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)各組獲得胰島的數(shù)量、純度、存活率及功能逐漸降低。熱缺血0分鐘、30分鐘、45分鐘組加入10nmol/LEx-4培養(yǎng)24h

7、后分離、純化的胰島數(shù)量及純度、活性均比未加入Ex-4培養(yǎng)組有所提高,熱缺血0分鐘組加入10nmol/LExendin-4的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05),而熱缺血30分鐘組及熱缺血45分鐘組加入10nmol/LExendin-4的實(shí)驗(yàn)組與未加入10nmol/LExendin-4的對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Exendin-4對(duì)不同熱缺血時(shí)間心死亡供體大鼠胰島細(xì)胞具有保