鹽酸克倫特羅的免疫學(xué)檢測(cè)新方法研究.pdf

1、本研究著重應(yīng)用免疫學(xué)和生物化學(xué)方法，構(gòu)建了基于ATP合酶的免疫旋轉(zhuǎn)生物傳感器，結(jié)合熒光技術(shù)檢測(cè)CL。具體研究?jī)?nèi)容如下： (1)應(yīng)用重氮化兩步偶聯(lián)法將鹽酸克倫特羅分別偶聯(lián)到牛血清蛋白和卵清蛋白上制得了免疫抗原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。用紫外分光光度法測(cè)定其偶聯(lián)比率分別為39：1和24：1。 (2)用BSA-CL免疫兔獲得了含有多克隆抗體的血清，經(jīng)硫酸銨沉淀、純化，得到兔源抗CL的抗體。在此基礎(chǔ)上建立了間接酶聯(lián)免疫

2、吸附檢測(cè)法，確定了抗CL抗體最適稀釋度為1：1000，羊抗兔酶聯(lián)抗體最適稀釋度為1：1500。經(jīng)測(cè)定，該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1046μg/L，生物檢測(cè)限為1.452μg/L，線性檢測(cè)范圍為7.26～90.75μg/L。 (3)用Ni-NTA親合層析柱提取純化了工程化嗜熱菌BacillasPS3上的TF1β亞基，并用其免疫BALB/c小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合與克隆篩選獲得2株分泌TF1β抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D5和4E7。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后

3、接種小鼠，收集腹水，獲得TF1β的單克隆抗體。 (4)從光合細(xì)菌R.rubrum中提取得到了其光合載色體chromatophores，經(jīng)電鏡觀察chromatophores的平均直徑為(76±16)nm。且具有較高的活性，可以作為研究ATP合酶水解和合成活性的實(shí)驗(yàn)材料。 (5)利用對(duì)pH變化敏感的熒光探針F1300標(biāo)記到chromatophores膜內(nèi)側(cè)，通過(guò)熒光強(qiáng)度變化表征ATP合成引起的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在ch

4、romatophores的β亞基上連接不同負(fù)載時(shí)，可以不同程度影響其ATP合成活性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的IRB可以通過(guò)“β亞基抗體-生物素-親和素-生物素-CL抗體”復(fù)合物捕獲溶液中不同濃度的CL，表現(xiàn)出不同的熒光增長(zhǎng)速率。IRB的捕獲機(jī)制同常規(guī)ELISA一致，但其檢測(cè)機(jī)制卻又明顯不同于ELISA一利用了ATP合酶在ATP合成過(guò)程中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)特性通過(guò)檢測(cè)熒光探針信號(hào)變化來(lái)反映，因此極大提高了檢測(cè)靈敏度，其感應(yīng)靈敏度可達(dá)10-12g/L。