鹽酸金霉素免疫學(xué)快速檢測方法研究.pdf

1、鹽酸金霉素（Chlortetracyline，CTC）是屬于堿性廣譜抗生素，它是從鏈霉菌培養(yǎng)液中提取制得的，能有效抑制革蘭氏陽性（G+）及陰性（G-）菌、衣原體、支原體等病原菌，對預(yù)防控制動物疾病及生長起到關(guān)鍵作用。因其濫用造成的細(xì)菌耐藥性問題日顯突出。因此，建立快速、靈敏的檢測鹽酸金霉素殘留手段，對其監(jiān)控體系和人類安全意義重大。本實驗通過分析鹽酸金霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)基礎(chǔ)上制備人工抗原；多抗及單抗的制備通過動物免疫及單克隆技術(shù)所實現(xiàn)

2、；間接和阻斷ELISA篩選高效價、高特異的單抗，制備及鑒定腹水采取體內(nèi)誘生法及間接和阻斷ELISA方法，研制鹽酸金霉素的免疫學(xué)檢測試劑。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用戊二醛法和碳二亞氨法（EDC）將 CTC與 BSA及 OVA進(jìn)行偶聯(lián)，制備人工抗原 BSA-CTC及 OVA-CTC。紫外掃描檢測器（UV）和凝膠電泳儀器（SDS-PAGE）對人工抗原進(jìn)行鑒定，間接和阻斷 ELISA鑒定鹽酸金霉素多抗血清。實驗結(jié)果表明 EDC法人工

3、抗原 BSA-CTC及 OVA-CTC成功制備；受免的5只 BALB/C小鼠效價均達(dá)1×10-3以上，獲得了高效價、高特異的多抗血清。其中3號小鼠多抗血清為強(qiáng)敏感，半數(shù)抑制濃度（50％ inhibitive concentration，IC50）為71.47ng/mL，與同系物四環(huán)素交叉反應(yīng)率為1.662%，與同系物土霉素交叉反應(yīng)率為0.714%和其他同系物及其它類藥物交叉反應(yīng)率小于0.08%。通過實驗獲得高效價、高特異性的鹽酸金霉素多

4、克隆抗體。⑵選高效價、高特異性3號小鼠為細(xì)胞融合備用鼠，將小鼠脾細(xì)胞與 NS0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，成功篩選6H5-H4，6H5-B2，3G9三株高效價、高特異的雜交瘤細(xì)胞株，采用體內(nèi)誘生腹水法制備鹽酸金霉素單抗（CTCmAb）。通過試劑盒亞型鑒定，單抗亞型為 IgG1；6H5-H4，6H5-B2，3G9三株單抗細(xì)胞上清效價分別為1:1.2×102、1:1.0×102和1:0.8×102，其中6H5-H4細(xì)胞株制成腹水效價為1:2.5

5、×104，鹽酸金霉素單克隆抗體親和常數(shù)Ka為4.05×1010L/moL，對鹽酸金霉素的半數(shù)抑制為29.86ng/mL；與同系物四環(huán)素交叉反應(yīng)率為1.48%，與其他同系物及其它類藥物無交叉反應(yīng)。通過實驗獲得高效價、高特異性的鹽酸金霉素單克隆抗體（CTCmAb），應(yīng)用于食品中鹽酸金霉素殘留快速檢測的免疫學(xué)試驗。⑶根據(jù)酶聯(lián)免疫分析方法，成功組裝鹽酸金霉素試劑盒（CTC-Kit）。試劑盒呈S型標(biāo)準(zhǔn)曲線，符合線性擬合，半數(shù)抑制IC50為29.8