重組人血管內(nèi)皮抑素治療惡性漿膜腔積液的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：觀察、探究重組人血管內(nèi)皮抑素（rh-Endostatin，商品名稱：恩度，英文名稱：Endostar，研發(fā)代號：YH-16）治療惡性漿膜腔積液的作用機制，評價Endostar漿膜腔內(nèi)灌注治療惡性漿膜腔積液的臨床療效和應(yīng)用安全性。
　　方法：本實驗研究選擇 BALB/C小鼠，采用 H22肝癌腹水瘤細胞株腹腔內(nèi)注射建立H22腹水瘤實驗?zāi)Ｐ汀?br>　?。?）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠作用的實驗 Endostar對荷H2

2、2腹水瘤小鼠作用的實驗動物分組：180只小鼠隨機分為6組，每組30只，Ⅰ組：陰性對照組（0.9％氯化鈉，0.2ml）；Ⅱ組：陽性對照組（順鉑1mg/kg）；Ⅲ組：低劑量治療組（Endostar5mg/kg）；Ⅳ組：中劑量治療組（Endostar10mg/kg）；Ⅴ組:高劑量治療組（Endostar15mg/kg）；Ⅵ組:聯(lián)合治療組（順鉑1mg/kg+中劑量Endostar10mg/kg）。腹腔內(nèi)隔日注射用藥，共3次，每次給藥前處死6只。

3、觀察小鼠一般情況，記錄小鼠體重變化，存活狀況，計算存活率，繪制生存曲線，收集腹水及血液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的濃度。
　?。?）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形態(tài)研究60只小鼠分6組，每組10只。分組同實驗（1）。小鼠腹腔積液長出后經(jīng)超聲檢查確認，各組均隔日腹腔藥物注射，調(diào)整藥物濃度，總共給藥3次。停藥1天后處死小鼠。腹膜標本光鏡HE染色，觀察腹膜血管及細胞形態(tài)學變化。比較生

4、理鹽水、順鉑及中劑量Endostar組腹膜微血管密度。電鏡觀察腹膜形態(tài)學變化。
　　（3）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子檢測40只小鼠分2組，中劑量連續(xù)給藥組（連續(xù)組）和中劑量隔2日給藥組（隔2日組）各20只；實驗采用中劑量組10.00mg/kg給藥，連續(xù)組d7，d8，d9，d10，d11，d12給藥，隔2日組分別于d7，d10給藥。均在d7，d13處死小鼠各10只。采用ELISA法和SP法分別檢測腹水、腹

5、膜組織中VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、存活素（Survivin）、Caspase-3、Caspase-9、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）和Bcl-xl的表達。
　?。?）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管機制研究78只小鼠共分為4組，中劑量給藥，連續(xù)組（2a）：d7，d8，d9，d10，d11，d12；隔日組（2b）：d7，d9，d11；隔2日組

6、（2c）：d7，d10；每周組（2d）：d7；連續(xù)組、隔日組分別于d7，d9，d11，d13處死小鼠每組6只，隔2日組于d7，d10，d13；每周組于d7，d13處死小鼠。對實驗腹膜組織分別進行Real-Time PCR檢測MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA，蛋白印跡法（Western blot）檢測腹膜蛋白表達水平。
　?。?）Endostar對惡性漿膜腔積液患者的區(qū)域灌注治療的臨床觀察晚期惡性腫瘤合并漿膜腔積液的

7、患者共60例，隨機分組，分為Endostar腔內(nèi)單藥灌注治療組（單藥組）31例，Endostar與順鉑聯(lián)合局部灌注治療組（聯(lián)合組）29例。超聲定位，“豬尾巴”導管積液腔內(nèi)穿刺導管留置術(shù)，盡可能放盡積液，單藥組由導管注入Endostar行局部區(qū)域灌注治療。胸腔積液或心包腔積液患者，Endostar單次注入30mg；腹腔積液患者，Endostar單次注入45mg，隔日1次，連續(xù)使用1-2周時間，視積液情況，每周1～2次維持。聯(lián)合治療組在單藥

8、基礎(chǔ)上聯(lián)合加用順鉑化療（聯(lián)合組），順鉑劑量30～40mg/m2。RECIST1.1“不可測量病灶”療效評價標準，計算臨床獲益率（DCR），評價生活質(zhì)量（QOL）以及NCI CTC3.0版標準評價毒副反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　?。?）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠作用荷H22腹水瘤小鼠腹水出現(xiàn)前（第1-6天），小鼠進食、飲水、活動以及排便等一般情況均良好；接種后約第6-7天開始，生理鹽水陰性對照組小鼠體重迅速增加；第9-10

9、天開始，荷瘤小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、呆滯少動，活動遲緩、反應(yīng)性差、食欲降低、糞便干燥等，腹水增長速度高于各用藥組；第11-12天開始，小鼠晚期呆滯少動，腹部極度膨隆，呈惡液質(zhì)狀態(tài)；第12天對照組小鼠全部死亡；Endostar與順鉑聯(lián)合組體重增加較慢，精神較好，中位生存期為17天。Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用顯示：實驗第9天，Endostar各劑量組及Ⅱ組較Ⅰ組出現(xiàn)的腹水量減少，荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計學意義，但是End

10、ostar各劑量組較Ⅱ組無統(tǒng)計學差異；第11天，Endostar各劑量組較Ⅰ組、Ⅱ組荷瘤小鼠有統(tǒng)計學意義；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組較Ⅲ、Ⅴ組荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計學意義；第13天，各組荷瘤小鼠的體重均發(fā)生了顯著的變化，組間比較均有統(tǒng)計學意義；第9天、第11天、第13天Ⅵ組較Ⅰ組出現(xiàn)的腹水量少，荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計學差異；較Ⅱ組有統(tǒng)計學差異；較Endostar各劑量組荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計學意義。Endostar對荷H22腹水

11、瘤小鼠生存時間的影響顯示：Ⅰ組中位生存時間為10.54士0.32天，時間最短；Ⅵ組最長，為17.01士0.31天，Endostar不同劑量組荷瘤小鼠的生存時間較對照組延長，差異顯著；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組較Ⅲ組生存時間差異有統(tǒng)計學意義；Ⅵ組較Ⅰ組、Ⅱ組、及Endostar各劑量組生存時間延長。Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹水及血清中VEGF表達的影響：實驗第9天Endostar各劑量組腹水及血清中的VEGF較Ⅰ組有統(tǒng)

12、計意義；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組腹水、血清中VEGF數(shù)值較Ⅲ、Ⅴ組差異有統(tǒng)計學意義；第11天各組間比較荷瘤小鼠腹水中VEGF數(shù)值下降明顯，均具有統(tǒng)計學意義；荷瘤小鼠血清中VEGF表達，在Ⅳ組、Ⅴ組較Ⅱ組比較有統(tǒng)計學意義；Endostar各劑量組間比較血清VEGF數(shù)值有統(tǒng)計學意義；第9天、第11天Ⅵ組腹水及血清中VEGF表達較Ⅰ組、Ⅱ組、Endostar各劑量組下降均有統(tǒng)計學意義。
　?。?）Endostar對荷H22腹水

13、瘤小鼠腹膜微血管形態(tài)學的影響觀察各組荷瘤小鼠腹膜和腹腔臟器表面未見有明顯的種植轉(zhuǎn)移瘤、轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成；腹膜光鏡檢查各用藥組腹膜血管及細胞形態(tài)未見明顯差異，用藥組未見大片細胞壞死及間質(zhì)血管減少現(xiàn)象。腹膜微血管密度（MVD）檢測中劑量Endostar組為13.96±0.59，與順鉑組14.24±0.40及生理鹽水對照組14.36±0.57比較，其MVD絕對數(shù)值稍有降低，但無統(tǒng)計學差異。腹膜的電鏡觀察顯示，生理鹽水組腹膜毛細血管的通透性明顯增強

14、，毛細血管完全由單層血管內(nèi)皮細胞連接而形成，細胞基底膜結(jié)構(gòu)破壞，毛細血管壁極薄，細胞之間連接較疏松，并可見大量線粒體水腫、空泡化現(xiàn)象；3個不同劑量的Endostar組可見腹膜毛細血管壁增厚，部分趨于正常；細胞間緊密連接，縫隙連接較多；線粒體水腫明顯減輕，并可見較多正常線粒體。提示Endostar可以減輕微血管損傷，使之趨于正常化。順鉑組小鼠腹膜毛細血管壁較薄，細胞基底膜損傷較重；細胞之間連接較疏松以及因小鼠生存時間延長導致線粒體出現(xiàn)代償

15、最終轉(zhuǎn)化為線粒體水腫數(shù)量明顯增多的現(xiàn)象；聯(lián)合治療組腹膜毛細血管壁明顯增厚；細胞之間連接緊密以及線粒體基本正常等血管正常化改變。
　　（3）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子檢測結(jié)果荷瘤鼠惡性腹腔積液中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等8個指標在藥物干預(yù)前水平明顯高于治療后，經(jīng)過Endostar干預(yù)治療后，各指標出現(xiàn)明顯的下降，即

16、Endostar可以明顯下調(diào)上述8個生物因子在腹腔積液中的表達水平。在治療方式比較上，隔2日給藥組腹水中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2表達水平下降的幅度更低，組間比較具有統(tǒng)計學意義。在對腹膜組織的組化染色比較上，也出現(xiàn)了與腹水ELISA檢測相似的研究結(jié)果。
　?。?）Endostar對荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管機制中劑量Endostar采用不同

17、給藥時間方式對荷瘤小鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA水平檢測以及蛋白表達水平的研究。Endostar采用連續(xù)給藥、隔日給藥、隔2給藥和每周給藥對荷瘤小鼠腹膜組織中MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相對表達的影響顯示，其相對表達明顯下降，并具有統(tǒng)計學差異。提示Endostar可以顯著的下調(diào)荷瘤鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA表達，分析比較中劑量En

18、dostar應(yīng)用各組的抑制、下調(diào)水平，提示隔2日組給藥對MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相對表達量的下調(diào)作用效果最優(yōu)，分別顯著強于連續(xù)、每周及隔日給藥組，差異顯著。提示，隔2日給藥組治療效果最佳。此研究趨勢在MMP-2、VEGF和Survivin蛋白表達的研究中其總體趨勢相近，但Endostar連續(xù)給藥組對MMP-2、VEGF和Survivin的蛋白下調(diào)效應(yīng)明顯優(yōu)于隔日給藥、隔2日以及每周給藥組，具

19、有統(tǒng)計學意義，提示連續(xù)給藥方式具有較大的治療優(yōu)勢和治療效應(yīng)；中劑量Endostar隔日、隔2日給藥作用效應(yīng)相近，未見組間差異，但兩組的作用效應(yīng)均優(yōu)于每周給藥治療組，具有統(tǒng)計學差異。
　?。?）Endostar對惡性漿膜腔積液患者的區(qū)域灌注治療的臨床觀察全組平均完成2.27個治療周期，平均治療持續(xù)時間為56.7天。患者治療順利，耐受性滿意，未見有因為藥物性不良反應(yīng)而退出臨床治療患者?；颊呓诏熜В篊R：10.00%，NCR/NPD：

20、58.33%，PD：31.67%，DCR：68.33%，亞組分析，單藥組合聯(lián)合組各指標分別為：6.45%、54.84%、38.71%、61.29%和19.77%、62.07%、24.14%、75.86%，其聯(lián)合組CR、NCR/NPD和DCR等指標絕對值均明顯優(yōu)于單藥組，但兩組間無統(tǒng)計學差異。全組患者治療后QOL均有不同程度的改善，單藥治療組QOL改善者17例，占54.84%；QOL穩(wěn)定者8例，占25.80%；QOL降低者6例，占19.3

21、5%。聯(lián)合化療組各指標對應(yīng)為18例，占62.07%；6例，占20.69%；5例，占17.24%。組間比較未見明顯差異?；颊咧委熤谐霈F(xiàn)的Ⅲ+Ⅳ度毒副反應(yīng)主要出現(xiàn)在聯(lián)合治療組患者中，單藥組未見發(fā)生。
　　結(jié)論：
　?。?）Endostar具有抑制小鼠惡性腹腔積液的生成和延長荷瘤小鼠生存期的作用，中劑量組較其他單藥劑量組顯示較好的效果，Endostar和順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用；
　?。?）Endostar通過下調(diào)荷瘤

22、小鼠腹腔積液中VEGF的產(chǎn)生和表達阻斷血管生成，抑制惡性腹腔積液的形成，此效應(yīng)在Endostar中劑量應(yīng)用組中表現(xiàn)更優(yōu)，并可能與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用。
　　（3）Endostar具有降低荷瘤鼠腹膜微血管密度絕對值的效應(yīng)，改善腹腔積液腹膜微血管超微結(jié)構(gòu)的效應(yīng)，降低膜血管通透性，修復細胞基底膜的損害結(jié)構(gòu)，細胞間連接緊密，改善線粒體水腫、空泡化狀態(tài)，引發(fā)線粒體代償性增多，促進血管正?；?。此效應(yīng)在Endostar與順鉑聯(lián)合給藥中

23、更加明顯。
　?。?）Endostar可能通過降低腹腔積液及腹膜組織中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等腫瘤相關(guān)因子的表達，降低血管通透性，保持基底膜完整性，誘導腫瘤細胞凋亡，改善腫瘤缺氧微環(huán)境，抑制惡性漿膜腔積液的生成。此效應(yīng)與不同給藥方法之間具有一定的差異。
　?。?）Endostar可以顯著的降低荷瘤鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和S