登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)單抗中和作用與作用機制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗體反應分析.pdf

1、登革病毒(DENV)屬于病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavivirus)，通過伊蚊等蟲媒叮咬進入人體。根據(jù)血清抗原性的不同分為四個血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，人類感染其中的任何一型，癥狀輕者表現(xiàn)為無癥狀感染或發(fā)熱，重者可出現(xiàn)嚴重威脅生命的登革出血熱(DHF)或登革休克綜合征(DSS)。登革熱主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，威脅著全世界2/5人口健康，但隨著國際交流日益頻繁、氣候變暖、城市

2、化進程加速等原因，登革病毒的流行范圍也隨之擴大。WHO數(shù)據(jù)表明，2000年后平均每年報道的感染人數(shù)達1億，每50萬～100萬例DHF/DSS中約有2.2萬例患者死亡，主要為兒童。登革病毒已成為全球公共健康的威脅。
　　 盡管登革病毒的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過60年，但迄今為止，尚未研發(fā)出安全有效的登革疫苗或特異性治療藥物，主要原因在于對DHF/DSS的發(fā)病機制了解不足。DENV初次感染后體內(nèi)能產(chǎn)生對四型病毒均有中和活性的抗體，但這一交叉保護

3、作用僅能持續(xù)幾個月，隨后交叉反應性抗體的中和活性下調(diào)。當二次感染異型登革病毒時，這些交叉反應性或亞中和活性抗體能促進病毒進入靶細胞而獲得大量復制，這一現(xiàn)象稱為抗體依賴的病毒感染增強效應(ADE)，研究表明，ADE是DHF和DSS發(fā)生的主要危險因素。
　　 登革病毒是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，呈二十面體結構，病毒體的直徑大約為50 nm，基因組大小為10.7 kb，編碼三種結構蛋白(structuralprotein)，分別

4、是衣殼蛋白（capsid，C）、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane，prM/M)和包膜蛋白(envelope，E)，以及七種非結構蛋白(NS)，分別是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是機能蛋白，它通過自身構象的改變或表面單元的重排，參與病毒與細胞吸附、病毒進入細胞、細胞膜融合以及病毒組裝等病毒生命周期的重要過程。E蛋白是暴露于病毒體表面主要成份，因此，宿主針對DENV產(chǎn)生的

5、中和抗體反應也主要針對這一蛋白。該蛋白在空間上形成3個不同的結構域(ED)，分別EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ，EDⅠ位于中央，呈β環(huán)狀結構，通過構象改變參與病毒進入靶細胞和核衣殼的脫殼;EDⅡ位于側部，含有在黃病毒屬中高度保守的融合環(huán)，參與細胞膜融合;EDⅢ呈免疫球蛋白樣折疊，被普遍認為含有與靶細胞受體結合的位點。三者均可在宿主體內(nèi)誘發(fā)抗體反應，但是研究表明，針對EDⅠ的抗體大多數(shù)是無中和活性的抗體;識別EDⅡ融合肽免疫顯性表位的抗體，在黃病

6、毒屬成員間存在廣泛的交叉反應，但大多無相對應的交叉中和活性;EDⅢ誘導產(chǎn)生的抗體中和活性最強，并且絕大部分為登革病毒特異性抗體。
　　 四型登革病毒之間E蛋白氨基酸序列同源性高達72％～80％，EDⅢ不僅存在血清型特異性中和表位，還存在登革病毒亞交叉或交叉反應性中和表位，因此，以EDⅢ作為登革疫苗研制的靶標可能產(chǎn)生同時針對四型登革病毒的中和抗體，具有廣譜抗病毒作用。由于目前尚無獲得批準的登革疫苗或抗病毒藥物，對登革病毒和其他相關

7、蟲媒病毒的保護主要還是通過中和抗體介導。動物實驗證明，EDⅢ中和抗體不管是被動免疫或是治療性免疫均能獲得很好的保護效果。因此，若能獲得具有強中和活性的EDⅢ抗體，在病毒感染早期有效中和體內(nèi)登革病毒，對控制疾病加重具有重大意義。由此可見，不管是登革病毒EDⅢ蛋白還是EDⅢ中和抗體在抗病毒研究中具有重要地位，它們是E蛋白廣譜交叉抗原表位分析、新型登革疫苗和抗病毒藥物研究的重要工具。
　　 明確中和抗體與病毒的相互作用對登革病毒致病和

8、免疫機制的闡明至關重要。目前所獲得的中和抗體的抗病毒特征絕大部分都來源于鼠源性單抗，動物實驗和體外實驗表明中和活性最強的抗體主要針對EDⅢ抗原表位，對其表位特征亦已清晰闡明，識別位點主要位于EDⅢ的側脊和A鏈區(qū)。盡管有研究發(fā)現(xiàn)登革熱患者血清EDⅢ抗體與中和活性存在關聯(lián)性，但近年來一些研究也發(fā)現(xiàn)EDⅢ抗體僅占抗病毒免疫血清中很小一部分，絕大部分為交叉反應性抗體，去除血清中EDⅢ抗體成份并未對血清的中和活性產(chǎn)生影響，推斷中和抗體識別表位可能

9、位于EDⅢ以外部分。因此，EDⅢ抗體在天然抗病毒免疫中作用存在爭議，明確登革病毒患者血清中和抗體反應的特點以及EDⅢ抗體對中和活性的作用，對于抗病毒的研究意義重大，也需要更多的臨床數(shù)據(jù)支撐。
　　 本研究分為以下兩個部分內(nèi)容:
　　 第一部分:登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)單抗的體內(nèi)外中和作用及其作用機制的初步研究
　　 登革病毒包膜E蛋白是病毒主要的結構蛋白，該蛋白在空間上形成3個不同的結構域（EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ）

10、。研究認為EDⅢ是參與病毒與宿主細胞吸附的區(qū)域，同時EDⅢ誘發(fā)的特異抗體的體內(nèi)外中和活性最強。因此，EDⅢ在登革病毒致病機制和抗病毒研究方面意義重大，已成為登革DNA或蛋白疫苗研制的重要靶標。本研究中，設想構建對四型登革病毒具有廣譜中和活性的EDⅢ反應單抗。在本實驗室前期研究中，以重組DENV1～4 EDⅢ單獨或混合免疫小鼠制備了一批EDⅢ反應性單抗，通過間接酶聯(lián)免疫吸咐實驗（ELISA）和免疫熒光實驗(IFA)測定它們對四型登革病毒的

11、反應特性，發(fā)現(xiàn)一株單抗能同時與四型病毒相結合，表明它是一株登革病毒群叉反應性單抗，命名為2D73。為了觀察單抗2D73對四型病毒是否也具有交叉中和活性，采用本實驗室建立的基于酶聯(lián)免疫斑點技術的微中和實驗方法（ELISPOT-MNT），測定單抗對四型登革病毒的體外中和活性，結果顯示單抗2D73對四型病毒均具有較強的中和活性，其50％抑制濃度（IC50）分別為0.28、0.16、0.18和18.82μg/ml。以用1日齡昆明乳鼠作為登革病毒

12、感染模型進行抗體體內(nèi)保護性效果評價，隨著抗體濃度的增加，乳鼠發(fā)病時間延遲、存活率顯著提高，呈明顯的濃度依賴關系，對四型登革病毒表現(xiàn)出與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護作用。由于目前普遍認為病毒與靶細胞結合的位點位于EDⅢ，因此EDⅢ抗體可能在抑制病毒與細胞吸咐方面具有重要作用。為進一步揭示2D73中和作用的機制，我們采用前后吸咐試驗檢測抗體在阻斷病毒與細胞吸咐的作用，結果發(fā)現(xiàn)抗體在前吸咐實驗能有效抑制病毒感染細胞，而在后吸咐試驗中抗體抑制感

13、染效果明顯降低，表明其中和作用主要通過抑制病毒與細胞表面受體的吸咐而有效阻斷了病毒進入細胞。對重組EDⅢ蛋白與2D73抗體Fab段的晶體結構分析發(fā)現(xiàn)，單抗2D73所識別表位在四型登革病毒中高度保守（見另一博士論文）。上述結果提示，包括2D73在內(nèi)的對DENV1～4中和活性強的抗體，它們所識別的高度保守性抗原表位有可能成為今后疫苗研制的重要靶標。
　　 第二部分:Ⅰ型登革病毒初次感染患者恢復期血清中和抗體效價與EDⅢ抗體滴度相關性

14、分析
　　 明確登革病毒感染患者中和抗體的反應特點，對于登革疫苗有效性評估、登革熱流行病學調(diào)查和感染診斷具有重要作用。目前對登革病毒中和抗體的研究大部分都基于鼠源性抗體，為了揭示天然免疫狀況下登革病毒感染者的中和抗體反應特異性，以及明確抗體中和活性與EDⅢ抗體水平的關系，在本研究中，收集了30例明確診斷為Ⅰ型登革病毒初次感染的患者恢復期血清，利用ELISPOT-MNT測定每例血清對四型登革病毒的中和抗體效價。并建立一種特異、可靠

15、的雙抗原夾心ELISA法用于檢測血清中EDⅢ特異性抗體的效價，該方法以酵母表達系統(tǒng)表達的重組EDⅢ蛋白作為抗原，捕獲血清中的特異性EDⅢ抗體，分析血清對DENV-1的中和效價與同型特異性EDⅢ抗體效價的相關性。研究結果顯示，這些患者的恢復期血清對DENV-1中和活性最強，而對其他三型病毒的中和活性遠不如前者。這一結果提示，與登革病毒感染初期體內(nèi)的抗體反應不同，隨時間推移，體內(nèi)針對其他血型的中和抗體中和活性下降，而同型特異性中和抗體的中和

16、活性上升，成為最具優(yōu)勢的中和抗體。30例血清的EDⅢ抗體效價高低差異大，高者達到1∶80，低者可低于臨界值，對DENV-1的中和效價與血清型特異EDⅢ抗體效價的相關性進分析，發(fā)現(xiàn)兩者不存在相關性(R=0.194，P=0.305)，這一發(fā)現(xiàn)與目前認為的型特異性EDⅢ抗體并非介導同型登革病毒中和的主要抗體的理論相一致。
　　 小結:
　　 綜上所述，本研究取得以下成果:
　　 一、獲得了一株對四型登革病毒交叉反應的E

17、DⅢ鼠源性單抗，該抗體對四型登革病毒均有較強的體外中和活性，并具有與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護作用。它通過阻斷病毒與細胞表面受體的吸咐而發(fā)揮中和作用。這一抗體可以進一步用于E蛋白廣譜交叉抗原表位分析和抗登革病毒的治療。并為新型登革疫苗的研制提供新的思路。
　　 二、建立了一種用于檢測登革病毒感染患者體內(nèi)EDⅢ抗體雙抗原夾心ELISA法，由于該方法采用酵母表達系統(tǒng)表達EDⅢ重組蛋白，蛋白具有更好折疊性，更接近于天然構象。因此，以

18、DENV-1 EDⅢ重組蛋白作為包被抗原，以標記了HRP的DENV-1 EDⅢ重組蛋白作為檢測抗原，測定患者血清中的特異性EDⅢ抗體，具有更高的特異性、更好的可靠性。
　　 三、用快速高通量的酶聯(lián)免疫斑點微中和實驗方法測定30例Ⅰ型登革病毒初次感染患者三年后恢復期血清對四型登革病毒的中和效價，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)血清對同型病毒的中和效價最高，遠高于對異型病毒的中和效價，證實了登革病毒初次感染可產(chǎn)生終生有效的同型中和抗體。但血清的對Ⅰ型登