淋球菌IgA蛋白酶中和表位表達(dá)載體的構(gòu)建及其誘導(dǎo)小鼠的粘膜免疫.pdf

1、【目的】: （1）構(gòu)建淋球菌IgA蛋白酶中和表位原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物6His-IgA蛋白酶中和表位融合蛋白，檢測(cè)融合蛋白的免疫原性。 （2）構(gòu)建淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表達(dá)載體，通過(guò)生殖道粘膜途徑接種，在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，誘導(dǎo)粘膜免疫，為研制人用高效抗淋病核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】： （1）IgA 蛋白酶中和表位原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其免疫原性鑒定通

2、過(guò)PCR 擴(kuò)增淋球菌MS11株IgA蛋白酶編碼基因1 601～2 722位序列，構(gòu)建pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表達(dá)載體；測(cè)序正確后在大腸桿菌M15中誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體重組蛋白經(jīng)8M尿素變性后通過(guò)鎳瓊脂凝膠FF分離純化，SDS-PAGE和Western-Blot分析及鑒定該純化蛋白；后者經(jīng)尿素濃度梯度透析復(fù)性、SDS-PAGE鑒定正確后，與佐劑混合于皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗淋球菌IgA蛋白酶中和表位的多克隆抗體；以復(fù)性

3、后的重組蛋白抗原包板，建立間接ELISA法，檢測(cè)兔免疫血清中IgA 蛋白酶中和表位的抗體效價(jià)。 （2）構(gòu)建IgA蛋白酶中和表位真核表達(dá)載體，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生粘膜免疫通過(guò)PCR擴(kuò)增淋球菌MS11株IgA蛋白酶編碼基因1 601-2 722位序列，構(gòu)建pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表達(dá)載體；經(jīng)鑒定后，制備重組質(zhì)粒殼聚糖混合顆粒，通過(guò)陰道灌注法免疫小鼠，誘導(dǎo)其產(chǎn)生粘膜免疫，對(duì)照組免疫不含重組質(zhì)粒的殼聚糖溶液和pcDNA3

4、.1(-)殼聚糖混合顆粒溶液；第3周和第5周加強(qiáng)免疫一次，間接免疫熒光法檢測(cè)目的抗原在小鼠陰道組織內(nèi)的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)小鼠血清﹑陰道沖洗液中抗IgA蛋白酶中和表位的IgA和IgG類抗體。 【結(jié)果】： （1）成功構(gòu)建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位的原核表達(dá)載體。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的淋球菌IgA蛋白酶中和表位序列與GenBank報(bào)道的一致。所克隆的基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以包涵體形式存在，Wes

5、tern-Blot結(jié)果顯示該純化蛋白能被抗6-His單抗識(shí)別，復(fù)性后得到溶解狀態(tài)的復(fù)性蛋白。免疫組兔血清中IgA蛋白酶中和表位抗體效價(jià)達(dá)1:6 400。 （2）成功構(gòu)建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表達(dá)載體。以殼聚糖為釋放系統(tǒng)經(jīng)陰道免疫后第4天開(kāi)始，通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)，在免疫組小鼠陰道上皮細(xì)胞中可以觀察到一定亮度的綠色熒光，提示IgA蛋白酶中和表位抗原能在小鼠陰道組織內(nèi)表達(dá)。免疫組小鼠陰道沖洗液中檢測(cè)到的抗IgA蛋白酶中和

6、表位的sIgA水平明顯高于對(duì)照組。 【結(jié)論】： （1）成功構(gòu)建了淋球菌pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表達(dá)載體，免疫動(dòng)物后獲得了具有較好免疫原性的純化復(fù)性IgA蛋白酶中和表位蛋白。 （2）成功構(gòu)建了淋球菌pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表達(dá)載體，其殼聚糖混合顆粒經(jīng)陰道免疫小鼠，能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的生殖道粘膜免疫。 （3）pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位蛋白能在小鼠陰道上皮組織內(nèi)