過氧化物酶體增殖物激活受體α對急性肝衰竭的保護作用與機制.pdf

1、目的:急性肝衰竭是一種由炎癥介導的肝細胞損傷過程，預后極差，其器官損傷的免疫學機制尚未完全闡明，尋求新的治療方法一直是該病研究的熱點和難點。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα)是由配體激活的核轉錄因子，已被證實參與了細胞脂質代謝、凋亡及炎癥反應等。盡管多項研究表明PPARα具有明確的抗炎作用，但在炎癥作為其主要病生理機制的急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中

2、，PPARα的作用及機制如何目前國內外尚無研究報道。本研究的目的在于探討PPARα對急性肝衰竭的保護作用與機制。
　　方法:本實驗共分如下兩部分。
　　1、動物實驗
　　通過D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）聯(lián)合脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射構建小鼠急性肝衰竭模型，檢測PPARα在疾病進展過程中的動態(tài)表達變化及組織分布情況;給予PPARα的選擇性激動劑Wy-1

3、4，643干預，觀察PPARα對小鼠急性肝衰竭是否具有保護作用;分別用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)及自噬相關基因7的小干擾RNA(smallinterferingRNAagainstautophagyrelatedgene7，siAtg7)抑制細胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉PPARα對小鼠急性肝衰竭的原有保護作用，以深入探討PPARα對D-GalN/LPS誘導的小鼠急性肝衰竭的作用機制。組織病理

4、學分析及血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)活性測定觀察肝組織損傷的嚴重程度;實時定量PCR(RealTime-PCR)檢測PPARα、促炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趨化因子(CXCL-1、CXCL-10)、自噬相關基因(ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的mRNA表達;蛋白印跡法(WesternBlot)檢測PPARα、炎癥信號通路相關蛋白（p-NF-κBp65、p-JNK、p-ERK、p-P

5、38）、自噬相關蛋白（LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1）的蛋白表達。
　　2、原代細胞實驗
　　通過LPS刺激小鼠骨髓來源的原代巨噬細胞(Bonemarrowderivedmacrophage，BMM)制作原代細胞炎癥模型，給予Wy-14，643干預，從細胞學水平觀察PPARα活化能否誘導細胞自噬，抑制炎癥反應;分別用3-MA、siAtg7抑制細胞自噬，觀察自噬受抑后能否逆轉PPARα的原有抗炎作用，以進一步探討

6、PPARα對急性肝衰竭發(fā)揮保護作用的細胞學機制。向原代巨噬細胞中轉染GFP-LC3質粒并于熒光顯微鏡下觀察以檢測自噬小體的形成情況;RealTime-PCR檢測促炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)、趨化因子(CXCL-1、CXCL-10)的mRNA表達;WesternBlot檢測自噬相關蛋白(LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1)的表達。
　　結果:
　　1、PPARα在急性肝衰竭時表達受抑，肝組織PP

7、ARα的mRNA和蛋白表達水平在急性肝衰竭疾病進展過程中逐漸降低。
　　2、PPARα活化促進了細胞自噬，抑制了急性肝衰竭時的炎癥反應，對急性肝衰竭產生保護作用。與急性肝衰竭模型組相比，PPARα的選擇性激動劑Wy-14，643干預組小鼠肝大體形態(tài)接近于正常的肝臟，肝小葉結構完整，部分肝細胞呈氣球樣變，小葉內及匯管區(qū)炎細胞浸潤不明顯，血清ALT、AST水平降低，促炎性細胞因子、趨化因子的mRNA及磷酸化的NF-κBp65、ERK、

8、JNK蛋白表達減少;自噬相關基因ATG-5、ATG-7、LAMP-1和蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1表達增加，且差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3、抑制自噬后加重了急性肝衰竭時的肝臟損傷和炎癥反應，逆轉了PPARα對急性肝衰竭的原有保護作用。分別用3-MA、siAtg7抑制自噬后，小鼠肝呈黝黑色，肝細胞大片狀壞死，肝索解離，肝小葉結構無法辨認，匯管區(qū)及壞死區(qū)可見大量中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，血清ALT、AST

9、水平升高，促炎性細胞因子及趨化因子的表達增加，且差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4、在原代巨噬細胞炎癥模型中，PPARα活化抑制了LPS誘導的炎癥反應，而且PPARα的抗炎作用具有劑量依賴性。RealTime-PCR結果顯示分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干預LPS誘導的原代巨噬細胞炎癥模型，觀察到促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達逐漸減少，表明PPA

10、Rα活化可抑制細胞炎癥反應，且PPARα的抗炎作用具有劑量依賴性。
　　5、在原代巨噬細胞炎癥模型中，PPARα活化促進了細胞自噬，而且PPARα對自噬的誘導作用具有劑量依賴性。我們分別用10μM、25μM、50μM的Wy-14，643干預已轉染入GFP-LC3質粒的原代巨噬細胞并于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)隨著Wy-14，643干預濃度的增加，原代巨噬細胞內自噬小體的形成逐漸增多;WesternBlot結果顯示隨著Wy-14，643

11、干預濃度的增加自噬相關蛋白LC3、ATG-5、ATG-7、LAMP-1的表達逐漸增多，說明PPARα活化可以誘導細胞自噬，且PPARα對自噬的誘導作用具有劑量依賴性。
　　6、細胞自噬受抑后，逆轉了PPARα的原有抗炎作用，加劇了LPS誘導的原代巨噬細胞炎癥反應。RealTime-PCR結果顯示與單用Wy-14，643激活PPARα相比，在加用3-MA、siAtg7抑制細胞自噬后，原代巨噬細胞中促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β

12、、IL-6及趨化因子CXCL-1、CXCL-10的mRNA表達增加，說明細胞自噬受抑可使PPARα的原有抗炎作用不復存在。
　　結論:
　　1、PPARα在急性肝衰竭的疾病進展過程中表達受抑。
　　2、PPARα活化通過促進細胞自噬減輕肝組織的炎癥反應，對急性肝衰竭產生保護作用。
　　3、抑制自噬可加重急性肝衰竭時的肝臟損傷及肝組織的炎癥反應，逆轉PPARα對急性肝衰竭的原有保護作用。
　　4、PPARα可