過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體β-δ在腦出血模型中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腦卒中是目前世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原因。其中，腦出血(intracerebralhemorrhage，ICH)占每年新發(fā)腦卒中病例的20％左右，具有較高的死亡率和致殘率。除了血腫本身造成的壓迫性損傷之外，ICH后血腫周?chē)X屏障的破壞導(dǎo)致了腦水腫，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的主要機(jī)制之一。目前，臨床上仍然缺乏相關(guān)的藥物對(duì)血腫周?chē)X組織血腦屏障進(jìn)行有效保護(hù)。
　　過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體β/δ(Peroxisome p

2、roliferator activated receptorβ/δ，PPARβ/δ)是細(xì)胞核信號(hào)受體家族的一員。與其他亞型相比，PPARβ/δ在腦組織中的表達(dá)水平最高。這一家族中的PPARγ業(yè)已被證明在ICH后起到神經(jīng)保護(hù)作用。然而與之相比，目前針對(duì)PPARβ/δ在腦卒中之后所扮演的角色研究甚少。已有的結(jié)果表明，在缺血性腦卒中的動(dòng)物模型中PPARβ/δ通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)于它在ICH后的作用仍缺乏相關(guān)研究。
　　血管

3、生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like4，ANGPTL4)是血管生成素和血管生成素樣蛋白家族中的成員。最早針對(duì)血管生成素樣蛋白4的研究發(fā)現(xiàn)，它能夠調(diào)節(jié)脂代謝，因而被認(rèn)為是一種脂肪因子。后來(lái)的深入研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素樣蛋白4同樣能夠調(diào)節(jié)血管通透性、血管新生以及炎癥反應(yīng)。此外，最新的研究證實(shí)在缺血性腦卒中的動(dòng)物模型中，ANGPTL4基因敲除的小鼠血腦屏障破壞顯著加重。盡管這一作用的具體機(jī)制目前仍不清楚，ANGPTL4對(duì)血腦屏障的

4、保護(hù)作用被認(rèn)為主要是通過(guò)抑制下游Src的磷酸化，從而減少了內(nèi)皮細(xì)胞之間連接蛋白的降解。然而，目前也缺乏ANGPTL4在出血性腦卒中的作用研究。
　　值得注意的是，針對(duì)腫瘤侵襲性的研究發(fā)現(xiàn)，激活PPARβ/δ可以顯著增加ANGPTL4的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。反之抑制PPARβ/δ的活性可以顯著降低ANGPTL4的表達(dá)。盡管如此，這一分子通路也沒(méi)有在ICH的研究中被證實(shí)。
　　因此，本研究的目的是探討PPARβ/δ在

5、出血性腦卒中動(dòng)物模型中的作用，并深入探索下游潛在的分子機(jī)制。
　　方法：
　　本研究總共使用212只8周齡CD-1小鼠。應(yīng)用自體尾動(dòng)脈注射模型進(jìn)行短期預(yù)后研究及機(jī)制研究，并應(yīng)用膠原酶注射模型進(jìn)行遠(yuǎn)期預(yù)后研究。造模后30分鐘通過(guò)腹腔注射給予不同劑量的GW0742。在遠(yuǎn)期預(yù)后研究中，采用有效劑量的GW0742進(jìn)行腹腔注射，每日一次并維持一周。造模前24小時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射ANGPTL4的小干擾RNA(small interferin

6、g RNA，siRNA)和對(duì)照RNA(scramblesiRNA)。機(jī)制研究中，GSK0660和重組的ANGPTL4分別通過(guò)腹腔和側(cè)腦室途徑注射。通過(guò)雙標(biāo)免疫組織化學(xué)法(double immunofluorescence staining)觀察PPARβ/δ和ANGPTL4在模型腦組織中不同類(lèi)型細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)腦水含量(brainwater content)的測(cè)定和行為學(xué)的評(píng)定來(lái)評(píng)估不同劑量GW0742的療效，并根據(jù)結(jié)果選用合適劑量用

7、于后續(xù)研究;在機(jī)制研究中，應(yīng)用免疫蛋白印記法(westernblot)檢測(cè)Src，磷酸化的Src(p-Src)，血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素(VE-Cadherin)，緊密連接蛋白(ZO-1，Claudin5)和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)水中，并應(yīng)用酶譜法(Zymography)測(cè)定MMP-9的活性。在遠(yuǎn)期預(yù)后研究中，用T迷宮(T-maze)，平衡疲勞試驗(yàn)(Rotrod)和水迷宮(Water-maze)等行為學(xué)來(lái)評(píng)估療效。計(jì)算小鼠腦重與

8、體重比值，并應(yīng)用蘇木精—伊紅染色法(Hematoxylin-eosinstaining，HE)對(duì)小鼠腦組織染色觀察腦室擴(kuò)大情況。
　　結(jié)果：
　　1.自體動(dòng)脈血注射ICH模型造模后半小時(shí)腹腔注射GW0742(0.5mg/kg and1.0mg/kg)，能夠顯著減輕ICH模型在造模后24小時(shí)及72小時(shí)的神經(jīng)行為學(xué)缺失并降低患側(cè)基底節(jié)區(qū)的腦水含量。
　　2.造模前24小時(shí)側(cè)腦室注射對(duì)應(yīng)的siRNA可以降低ANGPTL4的表

9、達(dá)，從而拮抗PPARβ/δ激活劑對(duì)腦水含量的降低和神經(jīng)行為學(xué)缺損的改善作用。
　　3.GW0742激活PPARβ/δ，通過(guò)ANGPTL4/Src分子通路減少緊密連接蛋白ZO-1，Claudin5，細(xì)胞黏附蛋白VE-Cadherin的降解，并可以減少M(fèi)MP-9的表達(dá)和降低其活性，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　4.ICH模型后一周（膠原酶模型），通過(guò)每日一次腹腔注射GW0742(1.0mg/kg)，能夠在遠(yuǎn)期改善小鼠的行為學(xué)損害，