過氧化物酶體增殖物激活受體α與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性肝衰竭中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。急性肝衰竭（acute liver failure,ALF）是短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的以大量肝細(xì)胞凋亡和壞死為特征的嚴(yán)重危及生命的臨床綜合征，病死率高達(dá)50％-70%。ALF常由肝炎病毒感染、藥物、酒精、毒物等因素誘發(fā)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為主要是免疫損傷、缺血

2、缺氧性損傷和內(nèi)毒素血癥等促進(jìn)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致ALF。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum,ER）是細(xì)胞蛋白合成、折疊、運(yùn)輸及鈣離子儲存的場所，肝細(xì)胞中有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮調(diào)控蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能。病毒感染、酒精或化學(xué)物質(zhì)等均可使肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS），嚴(yán)重的ERS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究表明，ERS在D-氨基半乳糖（D-ga

3、lactosamine,D-GalN）/脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）聯(lián)合注射誘導(dǎo)小鼠ALF中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα）是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了脂質(zhì)代謝、炎癥、細(xì)胞分化與凋亡等反應(yīng)。在腫瘤細(xì)胞中，一方面 PPARα的抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤形成；另一方面PPARα通過調(diào)控微環(huán)境抑制腫

4、瘤生長，提示PPARα在腫瘤細(xì)胞生長過程中的“雙刃劍”作用。但有關(guān)PPARα在ALF發(fā)病中作用的文獻(xiàn)還較為有限。PPARα具有抗凋亡作用，嚴(yán)重的ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，PPARα與 ERS間是否具有關(guān)聯(lián)、并可互相調(diào)控呢？目前關(guān)于兩者關(guān)系的研究也存在爭議，已有研究表明：激活PPARα可增加細(xì)胞ERS，另有學(xué)者應(yīng)用基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)PPARα缺失也可增加肝細(xì)胞的ERS，因此PPARα對細(xì)胞ERS的作用較為復(fù)雜。我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)活化PPARα

5、通過促進(jìn)細(xì)胞自噬，可以減輕肝組織的炎癥反應(yīng)，對D-GaIN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。但在以大量肝細(xì)胞凋亡和壞死為特點(diǎn)的ALF中，PPARα抗凋亡作用效應(yīng)如何目前尚無研究。
　　目的：本研究在腹腔注射D-GalN/LPS建立的C57BL/6小鼠ALF模型上應(yīng)用PPARα激動劑Wy-14643、PPARα小干擾RNA（smallinterfering RNA,siRNA）及ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-Phenylbu

6、tyric acid,4-PBA）分別調(diào)控PPARα和ERS水平，通過檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平，觀察肝組織的病理改變，肝組織內(nèi)PPARα、ERS和凋亡相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)變化，探討PPARα、ERS及其相互調(diào)控在ALF發(fā)生發(fā)展中的作用；進(jìn)一步分離小鼠原代肝細(xì)胞，應(yīng)用ERS誘導(dǎo)劑衣霉素（

7、tunicamycin,TM）、毒胡蘿卜素（thapsigargin,TG）建立細(xì)胞ERS模型，應(yīng)用Wy-14643或PPARα siRNA調(diào)控PPARα的表達(dá)，觀察細(xì)胞存活率，細(xì)胞上清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性，細(xì)胞內(nèi)PPARα、ERS和細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，明確PPARα在ERS進(jìn)展中的變化及對細(xì)胞凋亡的影響，從而深入探討PPARα與ERS在ALF中的作用和機(jī)制。從整體、組織、細(xì)胞水平

8、探討PPARα對于ALF的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用PPARα治療ALF提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.PPARα對急性肝衰竭小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的影響
　　健康清潔級8-12周雄性C57BL/6小鼠，重20-25g，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組：
　?、賹φ战M（n=10）；
　?、贏LF模型組（n=22）；
　　③PPARα激動劑（Wy-14643）組（n=22），通過腹

9、腔注射溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）中的D-GalN（700mg/kg）/LPS（10μg/kg）建立ALF模型，PPARα激動劑組于造模前2小時(shí)通過尾靜脈注射溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）中的Wy-14643（6mg/kg），對照組及模型組于造模前2小時(shí)注射等量DMSO。
　　ALF模型組和PPARα激動劑組各取10只，觀察其精神狀態(tài)、活動及24小時(shí)生

10、存率。每組剩余小鼠造模6小時(shí)后處死，獲取血清、肝組織。應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平；取部分肝組織以10%中性福爾馬林溶液固定，用于常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色；TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡和壞死情況；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測肝組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

11、（glucose-regulated protein78, Grp78）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose-regulated protein94,Grp94）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）mRNA表達(dá)；Western Blot檢測Grp78、Grp94、CHOP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinnyl aspartate specific proteinase-3

12、,Caspase-3）、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性肝衰竭中對PPARa的調(diào)控作用
　　健康清潔級C57BL/6小鼠，分為兩部分。第一部分：將小鼠隨機(jī)分為3組：
　?、賹φ战M（n=10）；
　?、贏LF模型組（n=14）；
　?、跡RS抑制劑（4-PBA）組（n=14），ERS抑制劑4-PBA（100mg/kg）于造模前6小時(shí)通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，造模6小時(shí)后將其

13、處死，應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測PPARα在肝組織中的表達(dá)及分布。
　　第二部分：將小鼠隨機(jī)分為5組：
　?、賹φ战M（n=10）；
　?、贏LF模型組（n=24）；
　?、跡RS抑制劑（4-PBA）組（n=24）；
　　④4-PBA+Control siRNA組（n=14）；
　?、?-PBA+PPARαsiRNA組（n=24），Control siRNA（50μM/

14、kg）和PPARαsiRNA（50μM/kg）于造模前24小時(shí)通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。ALF模型組、ERS抑制劑（4-PBA）組、4-PBA+PPARαsiRNA組，每組各取10只，觀察24小時(shí)生存率，其余小鼠均于造模6小時(shí)后處死，獲取血清、肝組織。
　　應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平；取部分肝組織用于HE染色；qRT-PCR和Western Blot法檢測小鼠肝組織Grp78、Grp94、CHOP mRNA和蛋白

15、表達(dá)。
　　3.PPARa調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制
　　分離小鼠原代肝細(xì)胞，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。應(yīng)用衣霉素（tunicamycin,TM）、毒胡蘿卜素（thapsigargin,TG）誘導(dǎo)細(xì)胞ERS，Wy-14643激活PPARα。實(shí)驗(yàn)分組：首先向肝細(xì)胞內(nèi)加入含TM或TG的DMSO溶液，TM（40μg/ml）或TG（1μg/ml）分別孵育肝細(xì)胞3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24

16、小時(shí)；或加入TM濃度分別為2.5,5,10,25,or50μg/ml或TG濃度分別為0.25,0.5,1,2.5, or5μg/ml的DMSO溶液，分別孵育肝細(xì)胞12小時(shí)，單加DMSO為對照組。qRT-PCR肝細(xì)胞中PPARαmRNA表達(dá)，Western Blot分別檢測PPARα、CHOP、Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)。隨后將肝細(xì)胞分為以下6組：
　　①對照組；
　?、赑PARαsiRNA組；
　?、跿M

17、組；
　?、躎M+PPARαsiRNA組；
　?、軹G組；
　?、轙G+PPARαsiRNA組，PPARαsiRNA（5nM）提前24小時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，之后TM（40μg/ml）或TG（1μg/ml）分別作用6小時(shí)。
　　最后將肝細(xì)胞分為以下6組：
　?、賹φ战M；
　　②Wy-14643組；
　　③TM組；
　?、躎M+Wy-14643組；
　?、軹G組；
　?、轙G+Wy-1

18、4643組，Wy-14643（50μM）提前2小時(shí)加入細(xì)胞內(nèi)，之后 TM（40μg/ml）或 TG（1μg/ml）分別作用24小時(shí)。
　　MTT法檢測細(xì)胞存活率；LDH活力定量測定試劑盒檢測細(xì)胞上清液LDH活性；Western Blot檢測肝細(xì)胞中PPARα、CHOP、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.PPARα對急性肝衰竭小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響
　　1.1.急性肝衰竭小鼠

19、PPARα表達(dá)受抑，細(xì)胞凋亡增加
　　我們前期的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)PPARα在ALF時(shí)表達(dá)降低，肝組織PPARαmRNA和蛋白表達(dá)水平在ALF進(jìn)展過程中逐漸降低。ALF模型組小鼠，注射D-GalN/LPS6小時(shí)后開始死亡，24小時(shí)的生存率是60%；血清ALT（1465.15±559.81U/L）、AST（4037.83±1774.55U/L）水平明顯增高；光鏡下，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索解離，肝細(xì)胞崩解、彌漫性大片壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤

20、；肝組織內(nèi)可見大量TUNEL陽性細(xì)胞；且Caspase-3蛋白表達(dá)量較對照組明顯減少，Cleaved caspase-3表達(dá)量明顯增加（P均<0.01）。
　　1.2.激活PPARα減少肝細(xì)胞的凋亡，對急性肝衰竭產(chǎn)生保護(hù)作用。與ALF模型組相比，PPARα的選擇性激動劑組小鼠24小時(shí)的生存
　　率是90%；血清ALT（524.53±380.83U/L）、AST（1227.15±362.84U/L）水平降低；肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，

21、肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤程度均得到改善；TUNEL陽性細(xì)胞減少；且與TUNEL結(jié)果一致，Caspase-3的表達(dá)明顯增多，Cleaved caspase-3的表達(dá)明顯減少，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。
　　1.3.激活PPARα減輕D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　ALF模型組小鼠肝組織內(nèi) ERS的標(biāo)志物Grp78、Grp94、CHOP mRNA和蛋白較正常對照組明顯增加；而Wy-1464

22、3預(yù)處理組上述指標(biāo)的表達(dá)水平較ALF模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性肝衰竭中對PPARα的調(diào)控作用
　　2.1.抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn) D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠PPARα的表達(dá)
　　我們前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)PPARα在ALF時(shí)表達(dá)隨著ALF進(jìn)展過程中逐漸降低。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)4-PBA可以減少 ERS的發(fā)生。qRT-PCR和Westwern Blotting結(jié)

23、果顯示，與ALF組相比，4-PBA預(yù)處理組明顯促進(jìn) PPARα的表達(dá)。肝組織免疫熒光檢測可以看到相同的結(jié)果，而且PPARα表達(dá)在胞漿而不是胞核（P均<0.05）。
　　2.2.抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活PPARα保護(hù)急性肝衰竭小鼠
　　4-PBA可以提高ALF小鼠的生存率；降低血清ALT、AST水平；保持肝小葉結(jié)構(gòu)的基本完整，減少肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤；降低ERS標(biāo)志物Grp78、Grp94、CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)。然而

24、當(dāng)我們用siRNA抑制PPARα的表達(dá)，明顯逆轉(zhuǎn)了4-PBA的保護(hù)作用：小鼠生存率降低；血清ALT，AST水平升高；肝小葉結(jié)構(gòu)破壞加重以及ERS標(biāo)志物Grp78、Grp94、CHOP表達(dá)明顯增高（P均<0.05）。
　　3.PPARα調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制
　　3.1.PPARα在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)展過程中的動態(tài)變化及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系
　　qRT-PCR和Westwern Blotting結(jié)果顯示與對照組相

25、比，短時(shí)間或低劑量TM、TG干預(yù)，PPARα表達(dá)增加，CHOP和Cleaved caspase-3表達(dá)減少；相反，長時(shí)間或高劑量的TM或TG干預(yù)，PPARα表達(dá)降低，CHOP和Cleaved caspase-3的表達(dá)增加（P均<0.05）。因此，輕度的ERS促進(jìn)PPARα表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重的ERS減少PPARα表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡。
　　3.2.調(diào)節(jié)PPARα影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　3.2.1.下調(diào)PPARα

26、減少輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)的細(xì)胞存活
　　輕度ERS條件下，即TM或TG孵育細(xì)胞6小時(shí)，PPARα表達(dá)增加，細(xì)胞存活率由于TM、TG的作用輕度下降，細(xì)胞上清中的LDH活性升高。我們用siRNA敲除 PPARα，細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞上清中的LDH活性明顯增高。Western Blot結(jié)果顯示，PPARα缺失明顯增加了CHOP和Cleaved caspase-3的表達(dá)（P均<0.05）。
　　3.2.2.上調(diào)PPARα減少嚴(yán)重內(nèi)

27、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　嚴(yán)重ERS條件下，即TM或TG孵育細(xì)胞24小時(shí)，PPARα表達(dá)降低，細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞上清中的LDH活性明顯增加。應(yīng)用PPARα激動劑Wy-14643預(yù)處理后，細(xì)胞存活率明顯增加，LDH活性明顯降低。Western Blot結(jié)果也顯示與單用TM、TG處理的肝細(xì)胞相比，Wy-14643明顯降低了CHOP和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平（P均<0.05）。因此PPARα可能是不同程度ER

28、S之間的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　1.激活PPARα通過抑制ERS及后續(xù)的肝細(xì)胞凋亡對ALF起保護(hù)作用。
　　2.抑制肝細(xì)胞ERS對ALF的保護(hù)作用是通過激活PPARα實(shí)現(xiàn)的。
　　3.輕度ERS促進(jìn)PPARα的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡，而嚴(yán)重的ERS抑制PPARα的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　4.PPARα在ERS進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用是復(fù)雜的。PPARα可能是輕度ERS減少細(xì)胞凋亡與嚴(yán)重ERS促進(jìn)細(xì)胞凋亡之間的調(diào)定點(diǎn)