高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2抗體制備與重組分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的急性傳染病。該病毒分為歐洲型和美洲型兩種基因型。2006年，我國爆發(fā)高致病性PRRS，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來極大的沖擊。NSP2是PRRSV中分子量最大、變異最大的蛋白，常作為

2、PRRSV監(jiān)控的靶點(diǎn)，同時(shí)其在PRRSV的復(fù)制、免疫、引發(fā)宿主細(xì)胞自噬和凋亡中發(fā)揮著重要功能。
　　本研究分離鑒定了1株2012年黑龍江省的美洲型HP-PRRSV，并命名為HH12株。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)成功克隆HH12株和實(shí)驗(yàn)室已鑒定的2株HP-PRRSV（JilinTN1株和JilinTN2株）的NSP2全長基因，測序結(jié)果3個(gè)分離株NSP2全長均為2850bp。將所克隆序列與美洲經(jīng)典型PRRSV NSP2比對，發(fā)現(xiàn)3個(gè)分離株的

3、NSP2基因均存在HP-PRRSV特征性的30個(gè)氨基酸缺失。遺傳進(jìn)化分析表明，3個(gè)分離株與HP-PRRSV代表株JXA1 NSP2基因序列相似性為98.5％～98.7％，且在遺傳進(jìn)化樹中屬于JXA1株為代表的亞群，并與HB0701株處于同一分支。
　　以JilinTN1株為研究對象，設(shè)計(jì)并合成能夠擴(kuò)增刪除了部分疏水區(qū)的NSP2片段的特異性引物，應(yīng)用RT-PCR對其進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建pGEX6p-NSP2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli

4、Rostta感受態(tài)細(xì)胞中通過原核表達(dá)重組NSP2蛋白，SDS-PAGE分析其大小約131.5 ku，經(jīng)Western-blot鑒定純化復(fù)性后的重組蛋白能夠與PRRSV陽性血清反應(yīng)。以該蛋白為免疫原，免疫新西蘭兔制備抗血清，4免后檢測其效價(jià)達(dá)1∶215，且與HP-PRRSV及經(jīng)典型PRRSV反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1∶211。western-blot結(jié)果表明所獲抗血清特異性較高。IFA結(jié)果顯示該多抗能夠檢測到Marc-145細(xì)胞上繁殖的HP-PRRS

5、V和經(jīng)典型PRRSV，且能夠與pVAX-NSP2轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的NSP2蛋白反應(yīng)。Real-time PCR結(jié)果顯示該抗體對HP-PRRSV和經(jīng)典型PRRSV具有較好的抑制效果，對兩者的最高抑制率分別為76.0％和58.6％。以上結(jié)果說明所制備的多抗生物學(xué)活性良好，為NSP2的深入研究提供很重要的基礎(chǔ)。
　　以GenBank數(shù)據(jù)庫中包括本研究克隆的624條美洲型PRRSV NSP2序列為研究對象，應(yīng)用RDP4.2軟件

6、對NSP2重組事件進(jìn)行檢測，同時(shí)應(yīng)用SIMPLOT軟件和MEGA5.2軟件從遺傳相似性和遺傳進(jìn)化兩個(gè)角度對重組事件進(jìn)行驗(yàn)證和分析。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)重組事件，共包含37個(gè)重組毒株，占總分析毒株的5.9％(37/624)，而本研究3個(gè)分離株的NSP2基因未發(fā)現(xiàn)重組。美洲變異型、傳統(tǒng)型和經(jīng)典型毒株均發(fā)現(xiàn)了重組:其中傳統(tǒng)型有3株，經(jīng)典型有7株，變異型有27株。這些重組事件中不僅存在7個(gè)型內(nèi)重組，還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)型間重組，檢測到的型間重組毒株主要由