高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和N蛋白單克隆抗體的制備及新型亞單位疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。該病于1987年首次報(bào)道于美國(guó),現(xiàn)已遍布全世界,給各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害。而近幾年在我國(guó)出現(xiàn)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的暴發(fā)與流行,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)幾乎造成了毀滅性的打擊。
　　 由ORF5基因編碼的GP5是PRRSV最主要的免疫原性蛋白,能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,但由于誘騙表

2、位A對(duì)中和表位B的覆蓋效應(yīng),現(xiàn)有的基于天然ORF5基因構(gòu)建的多種疫苗均難以產(chǎn)生較早和較高的中和抗體,但對(duì)ORF5基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?可以增強(qiáng)GP5的免疫原性。由ORF7編碼的N蛋白是PRRSV高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白,也具有極強(qiáng)的免疫原性。PRRSV感染豬后,最早產(chǎn)生的就是針對(duì)N蛋白的抗體,且持續(xù)時(shí)間極長(zhǎng),因此N蛋白是目前公認(rèn)最適合作PRRS診斷用的靶標(biāo)。
　　 近年來,植物病毒及其編碼的蛋白作為新型動(dòng)物疫苗的載體受到格外的關(guān)注。許多

3、植物病毒的衣殼蛋白可以在體外自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs),將外源肽展示在病毒粒子表面后具有很好的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,可以作為新型疫苗研究的重要平臺(tái)。
　　 本研究針對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒,開展了GP5蛋白和N蛋白單克隆抗體的制備,同時(shí),以植物病毒衣殼蛋白為載體,探討了PRRS新型亞單位疫苗。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.抗GP5單克隆抗體的制備
　　 以PRRSV WUH3株基因組

4、RNA為摸板,RT-PCR擴(kuò)增獲得截去信號(hào)肽的ORF5基因cDNA片段,片段大小約為540bp。BamHI和XhoI酶切后克隆到載體pGEX-KG構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-ORF5。在大腸桿菌中表達(dá)后提取包涵體免疫小鼠,制備單抗。經(jīng)ELISA篩選和Western blot驗(yàn)證,最終得到三株單抗,分別為2G8、3G8、1F12。三株單克隆抗體的小鼠腹水效價(jià)均達(dá)到100×28。
　　 2.抗N蛋白單克隆抗體的制備
　　 用Ba

5、mHI和HindⅢ分別雙酶切pET-30a和pGEX-KG-ORF7,回收連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-ORF7。原核表達(dá)后純化蛋白免疫小鼠,制備單抗,經(jīng)ELISA篩選獲得8株雜交瘤細(xì)胞,分別為:1A2、1D9、1F6、2C7、389、3H2、4D2和4E2。其中除1D9和4E2外,其余6株用真核表達(dá)的N蛋白作抗原經(jīng)Western驗(yàn)證結(jié)果均為陽性。小鼠腹水效價(jià)均為100×29。
　　 3.番木瓜花葉病毒農(nóng)殼蛋白介導(dǎo)的PR

6、RSV亞單位疫苗研究
　　 針對(duì)高致病性PRRSV WUH3株ORF5基因的特征,選取去除了信號(hào)肽但包含有中和表位B和覆蓋表位A的GP5 N端第26-66aa片段,將輔助性T淋巴細(xì)胞表位(PADRE)的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆蓋表位之間,將中和表位兩端的糖基化位點(diǎn)(N30、N34、N35和N51)消除,同時(shí)用中和表位替換覆蓋表位,并對(duì)ORF5基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,以期達(dá)到充分暴露中和抗體表位,誘發(fā)機(jī)體更強(qiáng)免疫應(yīng)答的目的