重組桿狀病毒介導(dǎo)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征基因工程疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種能夠?qū)е履肛i嚴(yán)重繁殖障礙及仔豬呼道癥狀和高死亡率的病毒性傳染病。免疫接種一直是預(yù)防病毒性傳染病的最主要手段，但目前針對(duì)PRRS的商品化滅活苗和弱毒苗存在免疫效果不理想或不安全的缺陷，尤其是近年來，由于高致病性PRRSV毒株的出現(xiàn)，由經(jīng)典PRRSV毒株制備的疫苗更是難以誘導(dǎo)針對(duì)高致病性PRRSV的有效保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此急需研制針對(duì)高致病性PRRSV的新型疫苗

2、。
　　 SFV復(fù)制子載體是基于西門利克森林病毒的真核表達(dá)載體，它不僅具有自主復(fù)制功能，能夠高水平表達(dá)外源基因，而且具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的特性。桿狀病毒是目前一種應(yīng)用十分廣泛的載體，主要用于基因治療和疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒載體可以攜帶哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)盒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而使外源基因得到高效及穩(wěn)定的表達(dá)。若經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎椈蝾A(yù)處理，還可介導(dǎo)外源基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，而其自身基因組并不復(fù)制和表達(dá)。<

3、br>　　 基于桿狀病毒的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及SFV復(fù)制子的自主復(fù)制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)為了消除桿狀病毒的補(bǔ)體敏感性，本研究利用囊膜表面展示水泡性口炎病毒G蛋白的假型桿狀病毒載體，構(gòu)建了基于SFV復(fù)制子的，共表達(dá)高致病性PRRSVWUH3株ORF3、ORF4、ORF5(修飾的ORF5)、ORF6四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.“

4、自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的構(gòu)建。
　　 擴(kuò)增高致病性PRRSVWUH3株的ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5）、ORF6基因以及西門利克森林病毒的26s亞基因組啟動(dòng)子，分別構(gòu)建了由26s亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ORF3、ORF4、ORF5(修飾的ORF5)、ORF6基因的表達(dá)盒，進(jìn)一步插入“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體pSCA1，獲得共表達(dá)ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5

5、）、ORF6基因的“自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 2.重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6的構(gòu)建。
　　 用SpeI和Sph1分別雙酶切質(zhì)粒pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6和載體pFastBac-VSV/G，將獲得的片段CMV/SFV-ORF3/4/5/6插入到載體pFastBac-VSV/G中，得到穿梭質(zhì)粒pFastBac-VSV/G-

6、CMV/SFV-ORF3/4/5/6。將構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，三抗篩選陽性重組子并提取重組Bacmid，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得共表達(dá)ORF3、ORF4、ORF5（修飾的ORF5）和ORF6基因的重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6。
　　 3.重組桿狀病毒BV-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
　　 將構(gòu)建的重組桿狀病毒BV

7、-G-CMV/SFV-ORF3/4/5/6以3種不同的劑量（109pfu/只，108pfu/只，107pfu/只）經(jīng)后腿肌肉注射免疫Balb/c小鼠，同時(shí)與共表達(dá)相同基因的“自殺性”DNA疫苗pSCA1-CMV/SFV-ORF3/4/5/6進(jìn)行比較。結(jié)果表明構(gòu)建的重組桿狀病毒能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并呈明顯的劑量依賴性，其中109pfu免疫組所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)最強(qiáng)，首免6周后針對(duì)GP5蛋白和全病毒的ELISA抗體滴度分別達(dá)到1:4480和1