CD80鼠-人嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、本研究在自行成功研制的鼠抗人CD80阻斷型單克隆抗體(4E5)的基礎(chǔ)上，采用嵌合抗體構(gòu)建方法，在真核細(xì)胞CHO中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，并對(duì)嵌合抗體生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。 第一部分：CD80鼠-人嵌合抗體的構(gòu)建及表達(dá) 從4E5雜交瘤細(xì)胞中抽取總RNA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)重、輕鏈基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用SMART-PCR方法擴(kuò)增含信號(hào)肽序列的VH和VL基因。同時(shí)用特異性引物從pIRES/hu5C11質(zhì)粒中擴(kuò)

2、增人IgGlγ鏈的Fc、CHl及k鏈的Ck基因。再利用TP-PCR方法分別將Fc、CHl和含信號(hào)肽序列的VH序列進(jìn)行拼接得到嵌合重鏈，Ck與含信號(hào)肽序列的VL序列進(jìn)行拼接獲得嵌合輕鏈。構(gòu)建共表達(dá)嵌合重、輕鏈的重組質(zhì)粒pIRES/ch4E5。pIRES/ch4E5重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)FCM檢測(cè)培養(yǎng)上清中嵌合抗體的瞬時(shí)表達(dá)后，再轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選，獲取持續(xù)穩(wěn)定分泌嵌合抗體的CHO-ch4E5細(xì)胞。研究結(jié)果表

3、明：成功構(gòu)建了含嵌合重、輕鏈基因的真核表達(dá)載體pIRES/ch4E5，并分別在293T及CHO細(xì)胞中得到瞬時(shí)表達(dá)及穩(wěn)定表達(dá)。 第二部分：CD80鼠-人嵌合抗體生物學(xué)功能的初步研究 大量收集CHO-ch4E5細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清，經(jīng)protein G親和層析法純化及Lowry法定量，SDS-PAGE鑒定嵌合抗體的純度及分子量，F(xiàn)CM分析嵌合抗體對(duì)多種腫瘤細(xì)胞Daudi、SH2-1及U937等細(xì)胞膜型CD80分子的識(shí)別。選擇天

4、然高表達(dá)CD80分子的人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi(陽(yáng)性表達(dá)率>90％)與ch4E5(終濃度為10μg/ml)共培養(yǎng)，MTT和FCM分析ch4E5對(duì)Daudi細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活的影響。采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法分析ch4E5與母本抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用及MTT對(duì)MLR的影響作用。ELISA檢測(cè)ch4E5與PBLs共培養(yǎng)后IL-2、INF-γ及IL-10的水平。結(jié)果表明：CHO-ch4E5細(xì)胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體的得率為4～5.8 mg/L。ch4E5能夠與4

5、E5相互競(jìng)爭(zhēng)抑制抗原抗體結(jié)合，并有效識(shí)別Daudi細(xì)胞膜型CD80分子(結(jié)合率為95.5％)。ch4E5能有效抑制Daudi細(xì)胞體外增殖(P=0.000067<0.05)，并誘導(dǎo)其凋亡。ch4E5抑制PBLs體外增殖(P=0.000012<0.05)，下調(diào)分泌IL-2(P=0.000156<0.05)及INF-γ(P=0.000001<0.05)，上調(diào)分泌IL-10(P=0.000035<0.05)。提示CD80嵌合抗體具有良好的生物學(xué)