人鼠嵌合型抗人CD19抗體Hm2E8b的研制及功能研究.pdf

1、單克隆抗體(單抗)特異性高,因此已經(jīng)廣泛用于疾病的診斷和治療,但是目前研制的單抗多為鼠源性的,在治療中反復(fù)使用,作為異源蛋白在人體內(nèi)可誘發(fā)產(chǎn)生人抗鼠免疫球蛋白抗體(HAMA),大大限制了它的臨床應(yīng)用。只有將其進(jìn)行人源化的改造,才能有效應(yīng)用于臨床治療。人鼠嵌合型抗體是指通過基因工程的技術(shù)和方法,將鼠源性單抗的可變區(qū)與人抗體恒定區(qū)拼接形成的抗體。目前較為成熟的做法就是將鼠單抗的可變區(qū)構(gòu)建成單鏈抗體與人Ig的Fc段結(jié)合,相對于其它人源化抗體具

2、有以下優(yōu)點(diǎn):技術(shù)路線簡單,易于操作；鼠源抗體的親和力和特異性得到了很好的保留；抗體的完整性好,在體內(nèi)的潴留時(shí)間長。
　　 CD19分子是B淋巴細(xì)胞表面發(fā)揮特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體,存在于B細(xì)胞成熟的各個(gè)階段,在大多數(shù)的非霍奇金淋巴瘤(NHL)和許多白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞上高表達(dá),目前已成為免疫治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。目前針對B系惡性腫瘤的治療,已經(jīng)有一些CD19特異性抗體治療,包括非結(jié)合

3、抗體,藥物共軛抗體以及雙特異性的抗體如CD19-CD3等,在體外實(shí)驗(yàn)、動物模型、以及早期的臨床實(shí)驗(yàn)中取得了較為理想的結(jié)果。但是還遠(yuǎn)沒能滿足臨床應(yīng)用的需要,技術(shù)上也還存在不少問題,因此有必要研究更多的CD19抗體。
　　 ZCH-4—2E8(簡稱2E8),是本院自行研制的鼠源性抗CD19單抗,本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,對此單抗進(jìn)行進(jìn)一步的基因工程改造,構(gòu)建可以表達(dá)人鼠嵌合型2E8抗體(Hm2E8b)的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞

4、中表達(dá),檢測Hm2E8b的生物學(xué)活性,為該抗體免疫毒素的研制和臨床應(yīng)用以及進(jìn)一步人源化改造打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.ZCH-4-2E8輕、重鏈信號肽和可變區(qū)基因克隆和序列分析。
　　 1)抽提2E8細(xì)胞RNA,并以此為模板,通過5’-RACE方法擴(kuò)增出2E8單抗輕鏈和重鏈的可變區(qū)片段,建立TA克隆,送測序。
　　 2)將測序結(jié)果與2E8輕鏈和重鏈的已知序列進(jìn)行比對,并通過SignalP3.0信號

5、肽預(yù)測服務(wù)軟件對2E8輕鏈和重鏈的信號肽進(jìn)行預(yù)測。
　　 2.真核表達(dá)載體pHMCH3-Hm2E8b的構(gòu)建。
　　 1)以pAc-κ-CH3載體為模板,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增出Fc片段,建立TA克隆,測序正確后,連入pcDNA3.1+載體,構(gòu)建pHMCH3載體。
　　 2)通過重疊延伸PCR的方法擴(kuò)增出scFv2E8片段,建立TA克隆,送測序,連入pHMCH3載體,構(gòu)建真核表達(dá)載體pHMCH3-Hm2E8b。

6、　　 3.Hm2E8b融合蛋白的表達(dá)和活性檢測
　　 1)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,以pHMCH3-Hm2E8b轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)G418加壓篩選。
　　 2)加壓篩選14天左右,RT-PCR,細(xì)胞免疫熒光,流式細(xì)胞儀分析法檢測陽性克隆。
　　 3)對陽性克隆進(jìn)行單克隆化,流式細(xì)胞儀分析法篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,命名為CHO-Hm2E8b。
　　 4)收集上清,SPA Sepharose親和層

7、析法純化嵌合抗體Hm2E8b,BCA法測定抗體濃度。
　　 5)SDS-PAGE和Western-Blot檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的重組蛋白Hm2E8b的表達(dá),并確定分子量大小。
　　 6)滴定實(shí)驗(yàn)和競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)了解嵌合抗體Hm2E8b的親和力。
　　 7)CDC實(shí)驗(yàn)檢測嵌合抗體Hm2E8b能否激活補(bǔ)體殺傷靶細(xì)胞。
　　 結(jié)果:
　　 1.ZCH-4-2E8輕、重鏈信號肽和可變區(qū)基因克隆和序列分析:經(jīng)S

8、ignalP3.0信號肽預(yù)測服務(wù)軟件分析,2E8輕鏈信號肽全長60bp,編碼20個(gè)氨基酸,2E8重鏈信號肽全長57bp,編碼19個(gè)氨基酸?？勺儏^(qū)序列與通用引物測序序列比較發(fā)現(xiàn)VL2E8序列有3處有差異,分別是3bp(T-C)、18bp(G—A)、19bp(A-T),VH2E8有5處存在差異,分別是1bp(G—C)、4bp(G-A)、6bp(G-C)、7bp(A—C)、13bp(G-C)。
　　 2.真核表達(dá)載體pHMCH3-Hm

9、2E8b的構(gòu)建:通過PCR擴(kuò)增人IgG1的Fc片段,將其插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1+,構(gòu)建pHMCH3載體。通過SOE-PCR擴(kuò)增scFv2E8片段,將其插入pHMCH3載體,構(gòu)建真核表達(dá)載體pHMCH3-Hm2E8b。
　　 3.Hm2E8b嵌合抗體的表達(dá)和功能的初步研究:以重組載體pHMCH3-Hm2E8b轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,G418加壓培養(yǎng)2周獲得能表達(dá)Hm2E8b抗體蛋白的CHO細(xì)胞。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞c

10、DNA可擴(kuò)增出目的條帶,細(xì)胞免疫熒光法檢查可見轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞內(nèi)含有目的蛋白。流式細(xì)胞儀分析法在轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到有活性的人鼠嵌合型CD19抗體Hm2E8b,陽性細(xì)胞率為93.32％,且嵌合型抗體Hm2E8b對其親本抗體2E8-FITC有明顯的阻滯作用。對陽性細(xì)胞進(jìn)行單克隆化,流式分析法篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)株CHO-Hm2E8b,該細(xì)胞株G418加壓培養(yǎng)3-4周后陽性細(xì)胞數(shù)可達(dá)96％以上。SPA Sepharose親和層析法純

11、化Hm2E8b抗體,BCA法測濃度濃縮純化抗體為2mg／ml,CHO-Hm2E8b細(xì)胞培養(yǎng)上清濃度約為15μg／ml。SDS-PAGE和Western—Blot鑒定Hm2E8b抗體單體分子量約50KDa,上清中還存在130KDa和200KDa大小的多聚體。CDC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hm2E8b能夠靶向殺傷CD19陽性的細(xì)胞Nalm6,該作用存在劑量依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 成功研制了有活性的抗人CD19人鼠嵌合型抗體Hm2E8b