MTB特異性蛋白CFP10和ESAT6在結(jié)核診斷中臨床應(yīng)用及作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　自古以來，結(jié)核分枝桿菌(MTB)作為一種具有極強(qiáng)傳染性的微生物，引起的結(jié)核病一直威脅著人類以及許多其他動(dòng)物的健康。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),全球新增約960萬人/年感染活動(dòng)性結(jié)核桿菌，有近150萬人/年死于結(jié)核病及其相關(guān)并發(fā)癥。在感染初早期快速且準(zhǔn)確的檢出結(jié)核桿菌及早開始治療可大大降低結(jié)核在人群中的播散。作為近幾年來快速發(fā)展的、可檢測抗原特異度細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的新技術(shù)，ELISP OT已被證明可用于診斷結(jié)核的活動(dòng)性與潛伏性感染。但基

2、于該原理的診斷試劑鮮有新的改進(jìn)。主要由于該檢驗(yàn)方法的主要影響條件尚不夠明確。全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)是近幾年來逐步發(fā)展成熟的一種可以在同一時(shí)間檢測大量基因的表達(dá)的新的檢測方法，其具有高通量和高靈敏性的特性。當(dāng)前主要的研究集中在ELISPOT是否可以正確快速的診斷不同人群、不同種類的結(jié)核，對于如何提高其診斷性能的研究較少。
　　目的：
　　驗(yàn)證重組特異性蛋白ESAT-6及CFP-10的生物活性，建立具有較高靈敏度和特異性的ELI

3、SPOT方法。以基因芯片為基礎(chǔ)，通過生物信息結(jié)果分析探討影響結(jié)核特異性蛋白ESAT-6及CFP-10作用于特異性T淋巴細(xì)胞的主要機(jī)制。
　　方法：
　　以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增CFP-10及ESAT-6基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后通過親和層析法純化CFP10和ESAT6重組蛋白，分別分析其蛋白純度。通過條件梯度的摸索建立可應(yīng)用于臨床的ELISPOT方法確定適合的ELISPOT方法實(shí)

4、驗(yàn)條件。
　　通過磁珠分選技術(shù)分選出CD4陽性的淋巴細(xì)胞，選取合適的表達(dá)譜基因芯片，篩選出蛋白刺激前后顯著差異表達(dá)的基因位點(diǎn)，根據(jù) GO分析及 KEGG分析，預(yù)測其對應(yīng)的通路。為今后的實(shí)驗(yàn)建立起對應(yīng)的結(jié)構(gòu)布局。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)已構(gòu)建穩(wěn)定的特異性蛋白表達(dá)體系,根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件建立了ELISOPT技術(shù)檢測結(jié)核桿菌感染的一系列實(shí)驗(yàn)步驟。
　　2.與T-Spot試劑盒進(jìn)行對比，ELISPOT的特異度與靈敏度分

5、別為82.35％和88.50%(χ2=0.57，P＞0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.通過芯片檢測刺激前后結(jié)核病人T細(xì)胞的差異位點(diǎn)，CFP-10刺激后表達(dá)上升相對應(yīng)基因參與BP的GO條目共1138條，參與CC的GO條目共31條，參與MF的GO條目共59條；表達(dá)下降相對應(yīng)基因參與BP條目共1273條，參與CC條目共154條，參與MF條目共181條。ESAT-6刺激后表達(dá)上升相對應(yīng)基因參與BP的GO條目共1295條，參與CC的G

6、O條目共112條，參與MF的GO條目共71條；表達(dá)下降相對應(yīng)基因參與BP條目共1089條，參與CC條目共112條，參與MF條目共139條。
　　4.聯(lián)合KEGG與差異表達(dá)基因的分析,上升和下降的通路中，CFP-10組與結(jié)核及IFN-γ相關(guān)的信號(hào)通路如下細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體、JAK-STAT、細(xì)胞粘附等；ESAT-6組與結(jié)核及IFN-γ相關(guān)的信號(hào)通路如下JAK-STAT、Toll樣受體、NF-κB、PI3K-Akt等