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文檔簡介
1、牛結(jié)核病是一種主要由牛型分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病,該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類疫病,其傳播流行影響著全球畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展及人類的健康。目前牛結(jié)核病臨床檢測的主要方法是PPD皮膚變態(tài)反應(yīng),但是PPD與環(huán)境中其它分枝桿菌存在交叉反應(yīng),導(dǎo)致檢測的特異性降低。ESAT6/CFP10是存在于致病性分枝桿菌中的優(yōu)勢抗原,其能引起動物感染早期的細(xì)胞免疫,但是在BCG疫苗株與禽結(jié)核分枝桿菌株中則沒有這種基因編碼,由此本研究選擇
2、ESAT6/CFP10作為臨床診斷牛結(jié)核病的目的抗原以提高檢測的特異性。
以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到目的基因,并克隆至pET32a(+)表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,隨后將其轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),得到45kd大小的蛋白。Western blot證實(shí),重組蛋白具有良好的生物活性。Ni-NTA金屬離子親和層析得到純化的目的蛋白。利用ESAT6/CFP10與牛型提純結(jié)核菌素(PPD-B)對5
3、0頭假定健康奶牛進(jìn)行臨床對比檢測,結(jié)果表明,ESAT6/CFP10組的陽性結(jié)果與PPD-B組的符合率為84.2%;利用ESAT6/CFP10和PPD-B作為刺激原進(jìn)行IFN-γ釋放試驗(yàn)的對比實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,ESAT6/CFP10組的復(fù)檢結(jié)果與PPD-B組的符合率為86.7%。由此可見,ESAT6/CFP10在牛結(jié)核病臨床診斷中有較好的表現(xiàn)。
為了進(jìn)一步探索ESAT6/CFP10對靶細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)活性的潛在影響,本研究制備了負(fù)
4、載重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ESAT6/CFP10的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383),經(jīng)1 ug/ml G418篩選,獲得了穩(wěn)定表達(dá)的巨噬細(xì)胞系。用WST-1法測定ESAT6/CFP10對巨噬細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明,10ug/ml ESAT6/CFP10對NR8383的增殖雖有明顯的抑制作用,但卻對負(fù)載目的基因的細(xì)胞系的生長有顯著促進(jìn)作用;用Griess法測定ESAT6/CFP10對巨噬細(xì)胞生成NO能力的影響,結(jié)果表明,ESAT6/C
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