結(jié)核桿菌ESAT-6基因的克隆擴(kuò)增及其在恥垢分枝桿菌和畢赤酵母中表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建結(jié)核桿菌ESAT-6基因穿梭質(zhì)粒，在恥垢分枝桿菌中表達(dá)蛋白并對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定，同時(shí)利用電轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到卡介苗中，為疫苗研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；構(gòu)建能在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的重組質(zhì)粒，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行基本生物學(xué)特性鑒定，為新型結(jié)核病疫苗的研究開發(fā)提供研究依據(jù)。
　　 方法：[1]從GenBank獲得結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因DNA序列，根據(jù)該序列及ps3000表達(dá)載體的要求，設(shè)計(jì)和合

2、成一對(duì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ESAT-6基因，并插入pGEMT載體，進(jìn)行PCR，雙酶切及測序鑒定。[2]亞克隆法構(gòu)建ps3000—ESAT-6大腸桿菌--分枝桿菌穿梭質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到恥垢分枝桿菌和卡介苗中，Western blot鑒定其生物學(xué)活性。[3]設(shè)計(jì)和合成畢赤酵母表達(dá)引物并引入酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增ESAT-6基因，并插入pGEMT載體，進(jìn)行PCR，雙酶切及測序鑒定。[4]亞克隆法構(gòu)建pPICZaA--ESAT-6穿梭質(zhì)粒，經(jīng)化

3、學(xué)轉(zhuǎn)化法整合畢赤酵母GS115染色體中，PCR鑒定目的基因的整合，Zeocin抗性篩選多拷貝重組子并誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用Western-blot鑒定其表達(dá)。
　　 結(jié)果：[1]成功擴(kuò)增了結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因；正確構(gòu)建穿梭質(zhì)粒ps3000-ESAT-6，用pET表達(dá)系統(tǒng)ESAT-6純化蛋白免疫小鼠的多抗血清通過Western blot證實(shí)了該重組恥垢桿菌中有表達(dá)并具有生物學(xué)活性。[2]從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出

4、ESAT-6基因片段，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-ESAT-6,SDS-PAGE顯示胞外并無表達(dá)，酵母細(xì)胞經(jīng)裂解后ESAT-6基因翻譯的蛋白加上載體的信號(hào)肽序列和c-myc表位一共18kDa左右在蛋白膠上相應(yīng)位置有表達(dá)，并且能被結(jié)核病人血清抗體所識(shí)別。
　　 結(jié)論：[1] ESAT-6基因重組恥垢分枝桿菌構(gòu)建成功，為下一步表達(dá)ESAT-6蛋白的重組BCG（Bacilli Calmette-Guérin）疫苗的研究奠定了基