結(jié)核桿菌ESAT-6基因的克隆擴增及其在恥垢分枝桿菌和畢赤酵母中表達(dá).pdf_第1頁
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1、目的:構(gòu)建結(jié)核桿菌ESAT-6基因穿梭質(zhì)粒,在恥垢分枝桿菌中表達(dá)蛋白并對重組蛋白進行鑒定,同時利用電轉(zhuǎn)化方法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到卡介苗中,為疫苗研究奠定實驗基礎(chǔ);構(gòu)建能在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)結(jié)核桿菌ESAT-6蛋白的重組質(zhì)粒,并對其表達(dá)產(chǎn)物進行基本生物學(xué)特性鑒定,為新型結(jié)核病疫苗的研究開發(fā)提供研究依據(jù)。
   方法:[1]從GenBank獲得結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因DNA序列,根據(jù)該序列及ps3000表達(dá)載體的要求,設(shè)計和合

2、成一對引物,利用PCR技術(shù)擴增ESAT-6基因,并插入pGEMT載體,進行PCR,雙酶切及測序鑒定。[2]亞克隆法構(gòu)建ps3000—ESAT-6大腸桿菌--分枝桿菌穿梭質(zhì)粒,經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到恥垢分枝桿菌和卡介苗中,Western blot鑒定其生物學(xué)活性。[3]設(shè)計和合成畢赤酵母表達(dá)引物并引入酶切位點,擴增ESAT-6基因,并插入pGEMT載體,進行PCR,雙酶切及測序鑒定。[4]亞克隆法構(gòu)建pPICZaA--ESAT-6穿梭質(zhì)粒,經(jīng)化

3、學(xué)轉(zhuǎn)化法整合畢赤酵母GS115染色體中,PCR鑒定目的基因的整合,Zeocin抗性篩選多拷貝重組子并誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用Western-blot鑒定其表達(dá)。
   結(jié)果:[1]成功擴增了結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因;正確構(gòu)建穿梭質(zhì)粒ps3000-ESAT-6,用pET表達(dá)系統(tǒng)ESAT-6純化蛋白免疫小鼠的多抗血清通過Western blot證實了該重組恥垢桿菌中有表達(dá)并具有生物學(xué)活性。[2]從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出

4、ESAT-6基因片段,成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-ESAT-6,SDS-PAGE顯示胞外并無表達(dá),酵母細(xì)胞經(jīng)裂解后ESAT-6基因翻譯的蛋白加上載體的信號肽序列和c-myc表位一共18kDa左右在蛋白膠上相應(yīng)位置有表達(dá),并且能被結(jié)核病人血清抗體所識別。
   結(jié)論:[1] ESAT-6基因重組恥垢分枝桿菌構(gòu)建成功,為下一步表達(dá)ESAT-6蛋白的重組BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基

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