結核分枝菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表達及其在牛結核病檢測中的應用.pdf

1、牛結核病(Bovinetuberculosis,bTB)是一種主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的人獸共患傳染病。該病在全球范圍內的流行，對公共衛(wèi)生造成嚴重的影響，也使經濟遭受重大損失。很多國家對牛結核的控制主要基于“檢疫-撲殺”的防控策略。盡管全球大范圍地對牛結核采取控制措施，但對其根除仍十分困難，某些官方宣布根除的國家依然檢測到該病的存在。
　　 鑒于分枝桿菌感染初期機體的免疫應答主要以細胞免疫為主

2、，故對牛結核監(jiān)測和預防控制主要是以細胞免疫應答(CMI)為基礎的檢測手段，包括結核菌素皮內變態(tài)試驗(TST)和γ-干擾素(IFN-γ)檢測試驗。其中應用最普遍的檢測方法是結核菌素皮內變態(tài)試驗，但是其檢測效果受限于敏感性和特異性。IFN-γ檢測在很多國家被應用，該方法主要檢測特異性抗原體外刺激全血后產生的IFN-γ水平。在實際應用中IFN-γ檢測主要是作為結核菌素皮內變態(tài)試驗的輔助檢測手段。這兩種方法使用的結核菌素純化蛋白衍生物(puri

3、fiedproteinderivative，PPD)是由分枝桿菌培養(yǎng)物滅活提純得到，成分比較復雜，作為檢測抗原其特異性易受交叉反應影響。CFP10和ESAT6是結核分枝桿菌特異蛋白，其編碼基因僅存在于致病性分枝桿菌中，禽結核、副結核等非致病分枝桿菌則不含有這兩種基因，因此，這兩種蛋白是良好的牛結核病診斷候選抗原。本研究應用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達并初步純化了CFP10-ESAT6蛋白，并對其在牛結核病檢測中的應用進行了評價。
　　

4、 1.結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表達和鑒定
　　 PCR擴增獲得cfp10-esat6融合基因，經篩選和測序鑒定正確后，克隆到pPICZαA表達載體，構建了重組質粒pPICZαA-(cfp10-esat6)，將其轉入畢赤酵母菌GS115。重組菌經甲醇誘導，采用親和層析的方法純化酵母培養(yǎng)液上清，SDS-PAGE檢測結果顯示33KD的目的蛋白被成功分泌表達。Westernblot結果顯示，CFP10-ESAT

5、6融合蛋白可以分別與抗CFP10單抗和抗ESAT6單抗發(fā)生特異性反應，顯示其具有較好的免疫反應性。經測定在最佳表達條件下酵母培養(yǎng)液上清中總蛋白量為25.2mg/L，采用親和層析初步純化后目的蛋白產量為18.3mg/L。
　　 2.結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白在牛結核病診斷中的初步應用
　　 將畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達的CFP10-ESAT6融合蛋白和大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達的該蛋白分別用于皮內變態(tài)試驗，檢測

6、陽性率低于同步進行的比較變態(tài)試驗，說明應用結核分枝桿菌特異性蛋白CFP10-ESAT6的皮內變態(tài)試驗結果的假陽性低于比較變態(tài)試驗。將融合蛋白皮內變態(tài)試驗結果與比較變態(tài)試驗結果作比較，結果顯示真核表達的CFP10-ESAT6融合蛋白皮內變態(tài)試驗符合率(59.3％)高于原核表達的該蛋白(49.4％)，尤其是對于比較變態(tài)試驗結果為陰性的個體，真核表達的CFP10-ESAT6融合蛋白皮內變態(tài)試驗結果與之符合率(83.3％)顯著高于原核表達的該蛋

7、白(54.5％)，顯示出較高的特異性。
　　 在牛結核病低陽性率牛群的IFN-γELISA檢測試驗中，以CFP10-ESAT6融合蛋白作為刺激原的檢測結果與PPD刺激的檢測結果符合率較高(97.6％)。對于牛結核病高陽性率牛群，將CFP10-ESAT6融合蛋白作為刺激原進行牛結核IFN-γ檢測試驗，檢測結果與PPD作為刺激原的IFN-γ檢測結果相比較，以真核表達的CFP10-ESAT6融合蛋白為刺激原的IFN-γ檢測結果符合率(