人KininogenD5和TRAIL融合蛋白的克隆表達(dá)和生物學(xué)活性研究.pdf

1、20世紀(jì)70年代初，F(xiàn)olkmall首先提出“腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”的論點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)證實(shí)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須有新生血管提供氧氣和養(yǎng)料，而血管新生是在原有的毛細(xì)血管或微靜脈基礎(chǔ)上，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細(xì)血管，是胚胎發(fā)育時(shí)期和女性月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜周期性剝脫修復(fù)時(shí)血管形成的主要方式，同時(shí)也是病理狀態(tài)下比如損傷后修復(fù)主要方式。血管新生主要受兩方面因素的調(diào)控，一是促

2、血管形成因子的增加，二是抑制血管形成因子的減少。在生理狀態(tài)下血管生成促進(jìn)因子和抑制因子之間達(dá)到一個(gè)平衡，但是在腫瘤的增大和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，血管新生促進(jìn)因子占據(jù)了優(yōu)勢(shì)，因此，如果抑制新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞將發(fā)生凋亡或壞死，這就為抗腫瘤的治療開(kāi)辟了新的思路。 目前，有多種抑制血管新生的藥物用于抗腫瘤治療的研究，單鏈的高分子量激肽原(HK)是一個(gè)分子量約為120kDa的球蛋白，在血漿中的濃度約為90μg/ml，從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，HK 由六

3、個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中1-3構(gòu)成它的重鏈，5-6構(gòu)成它的輕鏈，重鏈和輕鏈之間由包含有一個(gè)九肽的緩激肽的第四結(jié)構(gòu)域相連。在血漿的激肽釋放酶的作用下，釋放出一個(gè)九肽的緩激肽以后就形成了一個(gè)由約62 kDa的重鏈和約56 KDa的輕鏈形成的雙鏈分子，重鏈和輕鏈之間由位于第10位和596位之間的單一的二硫鍵連接。激肽釋放酶進(jìn)一步在該雙鏈的第419位精氨酸和420位的賴氨酸之間酶切，使短鏈縮短為約46 KDa大小，這樣形成的雙鏈高分子量激肽原被稱為活

4、化的高分子量的激肽原(HKa)。HK和Hka在結(jié)構(gòu)上都有第五結(jié)構(gòu)域的富含組氨酸區(qū)域，第五結(jié)構(gòu)域通過(guò)該區(qū)域與Zn<'2+>結(jié)合，通過(guò)電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)隨著HK活化成為Hka后，它的構(gòu)象發(fā)生了明顯的改變，其最主要的特征就是它的第五結(jié)構(gòu)域暴露，而第五結(jié)構(gòu)域的暴露使Hka獲得一個(gè)新的生物學(xué)活性，從而使它可以和活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的尿激酶纖溶酶原激活受體(uPAR)特異的結(jié)合，從而使活化的內(nèi)皮細(xì)胞去黏附而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制血管的新生。目前，對(duì)

5、于Hka誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管新生的作用機(jī)制已經(jīng)得到了比較明確的研究，對(duì)于其有功能的活性片段也已經(jīng)進(jìn)行了鑒定，但是對(duì)于單純的用Hka來(lái)進(jìn)行抗腫瘤的治療仍存在不少的問(wèn)題，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，單純用Hka來(lái)進(jìn)行治療會(huì)發(fā)現(xiàn)藥物的劑量較大，而且起效所需時(shí)間長(zhǎng)，因此，本課題通過(guò)將HK的活性片段D5<'[8]>和具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性、毒副作用小的腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體TRAIL<'[13]>的活性片段進(jìn)行融合，得到具有雙功能作用的融合蛋白，特異

6、性的殺傷腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞。 本課題運(yùn)用基因工程技術(shù)，分別獲得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>片段，分別鑒定其活性后，通過(guò)重組PCR技術(shù)，用氨基酸連接臂將兩個(gè)活性片段雙向重組連接，獲得了KininogenD5<,60-148>—TRAIL<,114-281>(KT)和TRAIL<,114-281>—KininogenD5<,60-148>(TK)，將得到的重組蛋白進(jìn)行活性鑒定

7、，發(fā)現(xiàn)KT具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞和殺傷新生血管內(nèi)皮的作用，而TK活性很小，在此基礎(chǔ)上還初步探討了KT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及KT的抗瘤譜。 一、KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的克隆、表達(dá)與活性鑒定 我們采用PCR技術(shù)分別獲得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>基因片段，分別構(gòu)建pMAL-KininogenD5<,60-148>(PKD5)和pMAL

8、-TRAIL<,114-281>(PT)的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E．Coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及2.5 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，親和層析，過(guò)濾，-80℃保存?zhèn)溆谩?大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP/KD5和MBP/T在E．Coli BL21中的菌體總蛋白含量分別為25％和 23％，誘導(dǎo)后得到了有效的表達(dá)，超聲破菌后，融合蛋白最主要在上清表達(dá)，經(jīng)Amylose Resin親和柱純化后，獲得了純化的MBP/KD

9、5和MBP/T融合蛋白，純化后純度分別達(dá)95％和 93％(Syngene掃描分析)，經(jīng)Werstern B10t鑒定在52 kDa和62 kDa處得到相應(yīng)的融合蛋白表達(dá)條帶。 用上述純化的PKD5和PT分別在ECV304和人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞SWl990上進(jìn)行活性鑒定，在geltalin和fibranectin包被以及在VEGF存在的情況下，PKD5對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的抑制作用，如果沒(méi)有Zn<'2+>存在的情況下，ED<,50>為1

10、0μg/ml，當(dāng)Zn<'2+>濃度為10nmol/L時(shí)，ED<,50>為50ng/ml；PT對(duì)SW1990有明顯的殺傷作用，ED<,50>為25 ng/ml。PT對(duì)于腫瘤細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡的作用，是很好的抗腫瘤藥物；通過(guò)管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，PKD5可以明顯的抑制體外管狀結(jié)構(gòu)的形成，因此具有潛在的抗腫瘤活性。 二、利用重疊PCR技術(shù)將KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>雙向融合表達(dá) 第一

11、部分的研究結(jié)果表明了KD5和TRAIL的活性片段都具有生物學(xué)活性，因此，我們將兩者的活性片段進(jìn)行融合得到一種新型的融合蛋白。這種新型融合蛋白的靶向能力是利用配體KininogenD5<,60-148>和活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的受體uPAR之間高度特異相互作用的特性和TRAIL<,114-281>和腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體特異性結(jié)合的特性。因此，KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>融合蛋白具有靶向殺傷

12、腫瘤細(xì)胞的能力，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備該融合蛋白。 首先，我們利用重組PCR技術(shù)，合成KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的雙向融合基因KT和TK，Kininogen和TRAIL之間通過(guò)氨基酸連接臂相連，將融合基因分別克隆NpMAL-c2載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL－KT和pMAL－TK，轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)。SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，人pMAL－KT

13、和pMAL－TK融合基因獲得了有效表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白質(zhì)的25％左右，主要以可溶的形式表達(dá)，經(jīng)Amylose Resin親和柱純化后，得到了純度在95％以上的純化蛋白MBP/KT和MBP/TK，利用純化蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV304和人胰腺膽管上皮細(xì)胞癌細(xì)胞SW1990的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明MBP/KT具有良好的雙功能活性，對(duì)ECV304細(xì)胞的IC<,50>為30 ng/ml，對(duì)于SW1990細(xì)胞的ED<,50>為5 ng/ml，而M