毛乳頭細胞HSPC016基因的全長cDNA克隆及功能分析.pdf

1、分布于體表的毛發(fā)具有調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝物、緩沖外界機械壓力等生理功能。對人類而言，毛發(fā)還具有社交媒介功能。分布于顏面、頭皮、外陰等處的毛發(fā)因毛干形態(tài)、色澤、密度各異而賦予個體不同的生理特征，在社會交往中給人以美的享受。因毛發(fā)生長異常而發(fā)生斑禿、多毛的患者往往承受極大的心理壓力，生活質(zhì)量受到影響。因此，弄清毛發(fā)胚胎期發(fā)生以及成熟毛發(fā)生長調(diào)節(jié)的機制，發(fā)展有效治療毛發(fā)疾病的藥物是目前毛囊生物學研究的熱點。 人類迄今對毛發(fā)生長調(diào)節(jié)的了解

2、主要來源于臨床觀察。通過對小鼠/大鼠模型的研究，一些與毛囊周期有關的調(diào)節(jié)分子如成纖維細胞生長因子(fibobalastgrowthfactors，F(xiàn)GFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)、刺猬蛋白(sonichedgehog，Shh)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophins)、血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)等被相繼鑒定出來。組成毛

3、囊的細胞，如DPC、外根鞘細胞(outrootsheath，ORS)、毛母質(zhì)細胞等可分泌這些生長因子及其受體；而且就單一細胞因子而言，其產(chǎn)生和分泌都與毛囊周期的特定時相有關。但是，關于這些細胞因子調(diào)節(jié)毛囊發(fā)生和毛囊周期的具體分子機制，如通過什么信號轉(zhuǎn)導途徑、與什么分子作用等均不十分清楚。 Inamatsu等在實驗中發(fā)現(xiàn)凝集生長狀態(tài)的DPC仍能保持誘導毛囊發(fā)生的能力。為了探索哪些基因在DPC凝集生長狀態(tài)下表達，篩選與DPC凝集生長

4、相關的基因，宋志強等通過抑制性消減雜交技術建立了人類DPC消減cDNA文庫，并從凝集生長狀態(tài)的DPC篩選出一批表達上調(diào)和表達下調(diào)基因。HSPC016即是通過上述方法篩選出的與DPC凝集生長相關的基因，它首次從CD34+造血干細胞/祖細胞(CD34+hematopoieticstem/progenitorcells，HSPC)中分離鑒定，但功能不清。鑒于DPC具有干細胞的特點，如自我更新能力、凝集性生長、處于愛保護的隱蔽位置、血供豐富等，

5、更有學者將DPC轉(zhuǎn)化為紅系及髓系血細胞并能在動物體內(nèi)維持達1年之久，我們推測HSPC016對維持DPC凝集性生長及其功能可能發(fā)揮重要作用。因此，本實驗首先從人頭皮毛囊中分離獲得DPC并建立DPC體外培養(yǎng)體系，進而使用RACE(rapidamplificationofcDNAends)技術對HSPC016在DPC內(nèi)表達的全長cDNA進行克隆，利用生物信息學工具預測其氨基酸序列及可能的功能，通過RNAi技術對其功能進行初步驗證分析。

6、 本課題研究結果顯示，DPC內(nèi)兩條HSPC016基因亞型的全長cDNA分別為400bp(GenBank序列號AY508979)和493bp(GenBank序列號)，為一進化保守基因。生物信息學分析及聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫查詢顯示HSPC016定位于染色體3q21.31；此基因包含一個195bp的開放讀框，預測蛋白為64aa小分子量可溶性蛋白，存在于核內(nèi)的可能性為56.5％，胞漿為26.1％，線粒體為17.4％；預測的HSPC016蛋白屬于PD053

7、992家族，含有一個跨膜結構域，其功能域與T2FA基因表達的蛋白具有最大同源性。T2FA蛋白又稱轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡFα亞單位，具有促進基因轉(zhuǎn)錄作用。綜合以上分析結果，HSPC016可能是細胞核內(nèi)某個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合體的亞單位，對基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。為了對HSPC016基因功能作初步驗證分析，我們依據(jù)HSPC016全長mRNA序列設計合成了3條小片段RNA干擾序列，將小RNA干擾片段插入干擾載體psilencer-3.1-H1-hygro并轉(zhuǎn)染

8、具凝集性生長特性的DPC。轉(zhuǎn)染至DPC內(nèi)的干擾載體利用細胞內(nèi)的酶系不斷合成干擾HSPC016基因表達的發(fā)夾狀小RNA干擾片段，使HSPC016基因在DPC內(nèi)的表達下降或消失。實驗結果顯示HSPC016表達陰性的DPC生長速度明顯減慢并失去凝集性生長特性，細胞形態(tài)由卵圓形或橢圓形變?yōu)樗笮位蜷L條狀的成纖維細胞樣細胞。這一結果表明HSPC016對調(diào)節(jié)DPC生長及其分化至關重要，是毛囊生長期維持DPC處于功能狀態(tài)的重要基因之一。 綜上所