斑馬魚g6pdM1315-1443突變型轉(zhuǎn)基因系的建立及鑒定.pdf

1、目的:建立斑馬魚 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因品系。實(shí)現(xiàn)目的突變型 g6pd基因在gata-1啟動(dòng)子的啟動(dòng)下特異性在斑馬魚紅細(xì)胞中表達(dá)，并標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EnhancedGreen Fluorescent Portein，EGFP）。進(jìn)而實(shí)現(xiàn)突變型g6pd在斑馬魚體內(nèi)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)顯性負(fù)效應(yīng)，在表達(dá)突變型G6PD蛋白的同時(shí)，影響正常G6PD的表達(dá)，致使G6PD活性減低，擬建立葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（

2、gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PDD）的斑馬魚生物模型，為進(jìn)一步研究G6PD缺乏癥發(fā)病的分子機(jī)制及大規(guī)模藥物篩選提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:構(gòu)建gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI重組質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)將本課題組已構(gòu)建完成的gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒與IsceI酶共注射入 tü

3、ebingen野生型品系斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，使 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)。通過觀察注射 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒后的斑馬魚胚胎中綠色熒光蛋白表達(dá)表達(dá)情況，初步篩選出血液循環(huán)中可以表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎飼養(yǎng)擬作為F0代。飼養(yǎng)F0代至繁殖期后，將每一條F0代魚與tüebingen野生型品系斑馬魚交配，同樣以觀察綠色熒光蛋白

4、表達(dá)的方法初步篩選出可以血液循環(huán)中可以表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎作為F1代。并利用基因組PCR法（genomic PCR）、全胚胎原位雜交（WISH）、蛋白印跡法（western blot）分別從DNA、mRNA、蛋白質(zhì)水平上鑒定 F1代 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因系斑馬魚是否表達(dá)目的轉(zhuǎn)基因gata1-g6pdM1315-1443-EGFP,并以地高辛標(biāo)記的反義band3 RNA作為探針，利用全胚胎原位

5、雜交初步檢測(cè)Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中紅細(xì)胞膜蛋白 Band3在 mRNAs水平上的表達(dá)情況，間接反映目的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚中紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性情況。
　　結(jié)果：將目的gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚單細(xì)胞胚胎中，并在斑馬魚血液循環(huán)中觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，以此篩選得到擬F0代，并獲得血液循環(huán)中表達(dá)綠色熒光蛋白的斑馬魚作為F1代，利用基

6、因組PCR鑒定F1代斑馬魚基因組中成功插入g6pdM1315-1443目的基因、全胚胎原位雜交鑒定F1代斑馬魚中有EGFP的mRNA表達(dá)信號(hào)、Western Blot鑒定得到F1代斑馬魚中存在g6pdM1315-1443-EGFP融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。從而證明目的質(zhì)粒 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI成功整合入斑馬魚基因組并表達(dá)，并成功轉(zhuǎn)錄RNA表達(dá)目的蛋白質(zhì)，鑒定出F1代轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的同時(shí)，篩選出

7、F0代轉(zhuǎn)基因系斑馬魚。并初步檢測(cè)出 F1代 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中 band3 mRNA的表達(dá)相比野生型tüebingen斑馬魚和gata1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚表達(dá)信號(hào)降低。
　　結(jié)論：成功建立斑馬魚 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因品系，使得突變型g6pdM1315-1443基因在 gata-1的啟動(dòng)下在斑馬魚紅細(xì)胞中特定表達(dá)，在表達(dá)斑馬魚異常