雙突變視紫紅質(zhì)蛋白(Rho-R135G-G188R)轉(zhuǎn)基因斑馬魚視網(wǎng)膜色素變性模型的建立.pdf

1、目的：建立一種視紫紅質(zhì)雙突變-R135G/G188R暫時性(transient)轉(zhuǎn)基因斑馬魚視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)模型，并檢驗該突變所致視網(wǎng)膜變性的特征。
　　 方法：將兩種經(jīng)基因工程改造的質(zhì)粒pXOP1.3-EGFP-rho和pXOP1.3-EGFP-rho-R135G/G188R通過顯微注射的方法導(dǎo)入野生型斑馬魚胚胎，制造出兩種暫時性轉(zhuǎn)基因斑馬魚(F0代)，分別表達外源性的野生型斑馬

2、魚視紫紅質(zhì)或其雙突變體(Rho-R135G/G188R)。用活體常規(guī)熒光顯微鏡觀察法篩選出增強型綠色熒光蛋白(EGFP)陽性的F0代轉(zhuǎn)基因幼魚。并用熒光和/或免疫熒光冰凍切片分析技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因視紫紅質(zhì)的水平和其在視網(wǎng)膜上的分布，以及視網(wǎng)膜變性的表現(xiàn)。
　　 結(jié)果：在本試驗中，1.3-kb的爪蟾視紫紅質(zhì)啟動子(Xenopus thodopsin promoter，XOP)片段足以替代全長5.5-kb的XOP啟動轉(zhuǎn)基因構(gòu)造表達。通過

3、常規(guī)熒光顯微鏡下觀察完整活體斑馬魚幼魚眼睛熒光表達情況以及圖像采集，可鑒別出成功的轉(zhuǎn)基因個體:三次顯微注射試驗總計約1000枚胚胎中，平均約5％-7％的幼魚呈EGFP陽性。冰凍切片分析顯示，魚卵受精后第5天(5 days post fertilization，5dpf)Rho-R135G/G188R表達水平即下降，相反，對照轉(zhuǎn)基因幼魚外源性視紫紅質(zhì)表達水平卻明顯升高；結(jié)合EGFP在視網(wǎng)膜上的分布位置分析，可能是轉(zhuǎn)入的雙突變視紫紅質(zhì)的表達

4、導(dǎo)致了視桿細胞特異性的視網(wǎng)膜變性，考慮到對照外源性轉(zhuǎn)基因視紫紅質(zhì)沒有引起此現(xiàn)象，提示視桿細胞死亡是呈R135G/G188R突變特異性的。
　　 結(jié)論：利用由細胞特異性啟動子加上帶有EGFP編碼序列標(biāo)簽的兩種RhoCDS片段組成的質(zhì)粒，可以成功制備出兩種暫時性轉(zhuǎn)基因斑馬魚RP模型；該模型證實1.3-kbXOP片段是一種跨物種性的足夠強的啟動子，也為II類視紫紅質(zhì)突變--R135G/G188R導(dǎo)致視紫紅質(zhì)蛋白折疊錯誤進而發(fā)生以視桿細