Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系的建立及對(duì)淋系造血因子的影響.pdf

1、目的和意義：Notch1基因是Notch基因家族的重要成員之一,在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育以及腫瘤形成等多個(gè)病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)超過(guò)60％的T-ALL患者體內(nèi)存在Notch1基因突變，但具體的機(jī)制并不明確。本課題擬在Tg(fli1:EGFP)斑馬魚(yú)中，轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞特異性rag2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人源性截短型Notch1基因（ICN1），并在下游連接紅色熒光蛋白（RFP），從中篩選并鑒定出發(fā)生T-ALL的斑馬魚(yú)，建立穩(wěn)定傳代紅綠雙熒光示

2、蹤的Notch1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)疾病模型以研究Notch1基因?qū)α芟翟煅δ芗把苄律挠绊?，為深入探?Notch1在促進(jìn)T-ALL發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制以及利用這種疾病模型進(jìn)行高通量的活體藥物篩選提供了研究平臺(tái)。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：構(gòu)建rag2-ICN1-RFP重組質(zhì)粒，顯微注射到單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎，利用熒光體視顯微鏡篩選出F0代，并建立穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因魚(yú)系至F2代。通過(guò)熒光體視顯微鏡、RT-PCR、Western blotting

3、驗(yàn)證ICN1基因和蛋白的表達(dá)，并利用流式細(xì)胞術(shù)、外周血涂片、熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RFQ-PCR)等方法鑒定轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)疾病表型的變化。結(jié)果在867條顯微注射重組質(zhì)粒的斑馬魚(yú)中，鑒定發(fā)現(xiàn)有20條（2.3%）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性斑馬魚(yú)，其中雄魚(yú)9條，雌魚(yú)11條，為F0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。流式細(xì)胞術(shù)和外周血涂片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)與對(duì)照組相比紅細(xì)胞比例顯著減少，淋巴細(xì)胞比例明顯增高。RFQ-PCR顯示與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)F1和F2代淋系關(guān)鍵造血調(diào)控因