OX40-OX40L共刺激信號(hào)分子在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、第一部分，OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子在支氣管哮喘患者中的表達(dá)及其意義
　　 目的:探討支氣管哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞OX40、OX40L的表達(dá)和血清中sOX40L的含量及其在哮喘發(fā)病中的意義。
　　 材料與方法:采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定19例健康志愿者和31例哮喘急性發(fā)作患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞OX40(分別為CD4+OX40+，CD8+OX40+)，單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上OX40L（分別為C

2、D14+OX40L+，CD19+OX40L+）的表達(dá)。采用ELISA方法檢測(cè)了19例健康志愿者,58例哮喘急性發(fā)作患者和24例哮喘穩(wěn)定期患者血清中sOX40L的含量。同時(shí)對(duì)所有受試者進(jìn)行肺功能測(cè)定。
　　 結(jié)果:(1)哮喘急性發(fā)作組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+的表達(dá)和sOX40L的含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。CD8+OX40+在兩組之間的表達(dá)水平相當(dāng)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)

3、學(xué)意義(P＞0.05)。(2)急性發(fā)作組sOX40L含量高于健康對(duì)照組和穩(wěn)定期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。而在哮喘急性發(fā)作患者中，sOX40L的含量與其肺功能(FEV1％Pred，F(xiàn)VC%Pred，F(xiàn)EV1FVC)存在顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.754，r=-0.557，r=-0.457;P值均＜0.01）;并且sOX40L含量在對(duì)照組、輕度組、中度組、重度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.14，p＜0.01)。
　　

4、結(jié)論:支氣管哮喘患者存在CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+表達(dá)的上調(diào)和血清sOX40L含量的增加，并且sOX40L含量和肺功能呈顯著負(fù)相關(guān)，是反應(yīng)哮喘患者病情嚴(yán)重程度的一個(gè)有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)，OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子可能在哮喘的發(fā)病中具有重要意義。
　　 第二部分，OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子在支氣管哮喘小鼠模型中的表達(dá)
　　 目的:探討OX40、OX40L分子在急性哮喘小

5、鼠動(dòng)物模型中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子在哮喘發(fā)病中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 材料與方法:通過(guò)建立急性哮喘小鼠動(dòng)物模型并對(duì)模型是否成功進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)哮喘模型小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞、肺泡灌洗液細(xì)胞、肺組織中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞表面的OX40、OX40L的表達(dá)進(jìn)行分析;運(yùn)用CCK8對(duì)哮喘小鼠T細(xì)胞增殖能力進(jìn)行觀測(cè);運(yùn)用ELISA方法對(duì)BALF和T細(xì)胞增殖上清液中IL-4、IFN-γ的

6、含量進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)運(yùn)用免疫組化對(duì)肺組織中OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。
　　 結(jié)果:(1)哮喘組小鼠具有典型哮喘發(fā)作樣癥狀;病理切片顯示肺組織及氣管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)明顯;BALF中細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01);在同等劑量乙酰甲膽堿(0.05、0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時(shí)，哮喘組肺阻力（lungresistance，RL）高于對(duì)照組，而肺動(dòng)態(tài)順

7、應(yīng)性(dynamiccompliance，Cdyn)則低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)；哮喘組BALF中IL-4含量高于對(duì)照組，而IFN-γ含量低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。(2)哮喘組外周血單個(gè)核細(xì)胞、肺泡灌洗液細(xì)胞、肺組織中CD4+OX40+、CD19+OX40L+、F4/80+OX40L+的表達(dá)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;而在哮喘組和對(duì)照組小鼠三種組織中，CD8+O

8、X40+的表達(dá)水平都相當(dāng)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。在哮喘組小鼠三種組織中，肺泡灌洗液和肺組織中的CD4+OX40+、CD19+OX40L+表達(dá)高于外周血，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。(3)T細(xì)胞經(jīng)Con（不加CD3）、CD3、CD3+IgG、CD3+OX40、CD3+DMSO、CD3+LY、CD3+OX40+LY處理后，哮喘組OD值均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為34.79,52.14,48.25

9、,42.93，25.96,4.12,5.30;P值均＜0.05）。而哮喘組T細(xì)胞各處理因素之間比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=516.90，P＜0.01)，CD3+OX40組OD值均高于其它組（P值均＜0.01），而加用PI3K抑制劑(LY294002)處理后(CD3+LY、CD3+OX40+LY)其增殖能力明顯低于其它組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01)。(4)哮喘組T細(xì)胞經(jīng)Con（不加CD3）、CD3、CD3+IgG、CD3+O

10、X40、CD3+DMSO、CD3+LY和CD3+OX40+LY處理后，上清液中IL-4和IFN-γ含量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。對(duì)于對(duì)照組和哮喘組來(lái)說(shuō)，各處理因素之間比較，上清液中IL-4和IFN-γ的含量差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為31.95、34.39，109.93、62.94;P值均＜0.01），其中CD3+OX40組IL-4和IFN-γ的含量均高于其它組（P值均＜0.05），而加用PI3K抑制劑后(

11、CD3+LY、CD3+OX40+LY)其T細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ的能力均較CD3+OX40組減弱（P值均＜0.05）。(5)哮喘組小鼠BALF中IL-4含量明顯高于對(duì)照組，而IFN-γ含量低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為14.31，15.28;P值均＜0.01）。(6)免疫組化分析顯示:哮喘組肺組織中OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　

12、 結(jié)論:(1)成功建立了BALB/c小鼠急性哮喘動(dòng)物模型，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。(2)哮喘組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞、肺泡灌洗液細(xì)胞和肺組織中T淋巴細(xì)胞OX40、B淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞OX40L分子存在表達(dá)上調(diào)，并且肺組織中存在OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白的高表達(dá)。(3)OX40/OX40L共刺激信號(hào)分子在T細(xì)胞體外增殖中具有重要作用，而PI3K抑制劑可以阻斷該信號(hào)介導(dǎo)的增殖效應(yīng)。OX40/OX40L共刺激信號(hào)是

13、否通過(guò)P13K/AKT信號(hào)途徑參與哮喘的發(fā)病值得進(jìn)一步深入探討。
　　 第三部分，阻斷性O(shè)X40LmAb在支氣管哮喘小鼠模型中的干預(yù)效應(yīng)及其機(jī)制
　　 目的：探討OX40/OX40L共刺激信號(hào)是否通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)途徑參與哮喘的發(fā)病。
　　 材料與方法：通過(guò)建立急性哮喘小鼠動(dòng)物模型，分別采用阻斷性O(shè)X40LmAb（OX40L組）和P13K抑制劑(LY294002)（LY組）干預(yù)，并設(shè)立正常對(duì)照組(Con組)

14、、哮喘組（Asthma組）、IgG同型對(duì)照組（IgG組）和載體DMSO組（DMSO組），觀察小鼠癥狀、氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)以及白細(xì)胞分類(lèi)和BALF中細(xì)胞因子的變化情況；同時(shí)采用免疫組化法對(duì)肺組織中t-Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:(1)采用阻斷性O(shè)X40LmAb干預(yù)后，與Asthma組和IgG組相比，OX40L組小鼠哮喘樣癥狀相對(duì)較輕，肺部及支氣管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)減少;采用同等劑量乙酰

15、甲膽堿(0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時(shí)，OX40L組較Asthma組RL有所降低，但仍高于正常對(duì)照組，Cdyn高于Asthma組，但仍低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05);OX40L組BALF中細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;OX40L組BALF中IL-4含量低于Asthma組，但是明顯高于對(duì)照組，與之相反，OX40L組IFN-γ含量高于Asthma組，

16、但是低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;免疫組化顯示，Con、Asthma、IgG和OX40L各組間t-Akt、p-Akt蛋白的IOD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為179.39、46.45，P值均＜0.01），而OX40L組p-Akt的IOD值高于對(duì)照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。(2)采用LY294002干預(yù)后，與Asthma組和DMSO組比較，LY組小鼠哮喘樣癥狀相對(duì)較輕，肺部及

17、支氣管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)減少;采用同等劑量乙酰甲膽堿(0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時(shí)，LY組RL低于Asthma組，但仍高于對(duì)照組，而Cdyn高于Asthma組，但仍低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05);而LY組BALF中細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;LY組BALF中IL-4含量比Asthma組低，但是高于對(duì)照組，與之相反，LY組lFN-γ含量高于Ast

18、hma組，但是低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）;免疫組化結(jié)果顯示，Con、Asthma、DMSO和LY各組間t-Akt、p-Akt蛋白的IOD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為131.28、34.73，P值均＜0.01)，而LY組p-Akt的IOD值高于對(duì)照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　 結(jié)論:1）運(yùn)用OX40LmAb和PI3K抑制劑(LY294002)對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行體內(nèi)