雷帕霉素對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期的共同途徑和主要病理特征，其病理改變表現(xiàn)為腎小管萎縮，間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度積聚。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，腎小管間質(zhì)病變程度預(yù)示著腎功能受損的程度，決定慢性腎臟病患者的預(yù)后。間質(zhì)纖維化的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的方法阻斷腎纖維化的進(jìn)展。
　　雷帕霉素是一種從放線菌培養(yǎng)液中提取出來(lái)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其在體內(nèi)的

2、直接作用靶點(diǎn)是mTOR(mammalian target of rapamycin)。mTOR是控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所必需的絲/蘇氨酸激酶，雷帕霉素通過(guò)與mTOR結(jié)合后，激活細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和存活反應(yīng)，因其對(duì)細(xì)胞具有非選擇性抑制增殖作用，其研究及應(yīng)用廣泛，目前在臨床上主要作為免疫抑制劑，主要用于器官移植抗排異反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，RAP可抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖，包括抑制PKD大鼠模型囊性和非囊性小管的增殖，并可減輕腎間質(zhì)纖維化，但其作用機(jī)制卻未

3、完全明確。本研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteric obstruction，UUO)建立腎間質(zhì)纖維化模型，動(dòng)態(tài)觀察雷帕霉素對(duì)梗阻側(cè)腎臟的病理改變及生化指標(biāo)的影響，觀察雷帕霉素對(duì)腎臟纖維化進(jìn)程中AQP2與EnaC，Bcl-2與Bax、casepase-3等相關(guān)調(diào)控因子的影響，tune1染色觀察其對(duì)凋亡的影響，深入探討其對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響及可能機(jī)制，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化尋找新的途徑。
　　第一部分

4、：雷帕霉素對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎功能及殘余腎組織形態(tài)學(xué)的影響
　　目的:觀察雷帕霉素對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎臟病變的影響
　　材料與方法：
　　1.動(dòng)物模型制備與分組給藥
　　72只雄性wistar大鼠（購(gòu)于溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組，單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO)，雷帕霉素干預(yù)組(Rap)。假手術(shù)組開(kāi)腹后游離左側(cè)輸尿管隨即縫合皮膚，UUO組和雷帕霉素治療組進(jìn)行左側(cè)輸尿管雙結(jié)扎，治療組在UUO的基礎(chǔ)

5、上每天以雷帕霉素2mg/Kg.d(0.4ml/d)灌胃;假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃。
　　三組大鼠分別于術(shù)后第4天，7天、14天處死前留取24小時(shí)尿，進(jìn)行24h尿蛋白及尿鈉檢測(cè);于處死時(shí)末股動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清BUN、Cr，取部分腎組織行HE、Masson染色光鏡下觀察腎臟病理改變，并采用百分比評(píng)分法進(jìn)行腎臟間質(zhì)纖維化指數(shù)的半定量分析。
　　結(jié)果:
　　三組于第4，7，14天尿鈉水平比較未見(jiàn)明顯差異(P＞0.

6、05)，第14天數(shù)值Rap組高于UUO組，與假手術(shù)組比略低，三組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后第4、7、14天，假手術(shù)組，與UUO組及Rap治療組的24h尿蛋白定量三組無(wú)顯著性差異(P＞0.05);各組大鼠的血肌酐，血尿素氮在各時(shí)間點(diǎn)比較未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05);HE與Masson染色示:假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)腎臟未見(jiàn)病理病變。UUO組術(shù)后第4天出現(xiàn)腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及輕微腎間質(zhì)纖維化，并隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，Rap與UUO組在各時(shí)間點(diǎn)相比

7、較，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化相對(duì)減輕;腎間質(zhì)纖維化的半定量分析示UUO組與假手術(shù)組比較，腎間質(zhì)纖維化明顯(P＜0.05);Rap組腎間質(zhì)纖維化明顯輕于UUO組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　雷帕霉素可減輕腎間質(zhì)纖維化的程度，對(duì)梗阻腎臟具保護(hù)作用。
　　第二部分：雷帕霉素對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織AQP2及ENaC表達(dá)的影響
　　目的:
　　通過(guò)測(cè)定梗阻側(cè)腎臟AQP2及ENaC的表達(dá)探討雷帕霉素對(duì)梗阻腎

8、功能保護(hù)作用。
　　方法:
　　動(dòng)物模型制備與分組給藥同第一部分;用免疫組化法觀察腎組織AQP2及ENaC的表達(dá)，Westem雜交分析法檢測(cè)AQP2及ENaC蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　各組大鼠腎組織AQP2及ENaC蛋白的免疫組織化學(xué)分析:EnaC在假手術(shù)組中各時(shí)間點(diǎn)均可于腎臟近髓質(zhì)連接管和集合管上皮細(xì)胞見(jiàn)大量棕黃色顆粒，AQP2于腎臟髓質(zhì)深部集合管部上皮細(xì)胞胞漿及胞膜處大量表達(dá)，二者在腎間質(zhì)及腎小球未見(jiàn)表

9、達(dá);UUO組、Rap組較假手術(shù)組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞減少，表達(dá)強(qiáng)度減弱(P＜0.01);與雷帕霉素組比較，UUO組減少更為明顯(P＜0.05)。
　　AQP2及ENaC蛋白表達(dá)的Western Blot定量分析結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致
　　結(jié)論:
　　在單側(cè)輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化模型中，雷帕霉素減少了AQP2及ENaC蛋白的丟失。
　　第三部分：雷帕霉素對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3表達(dá)

10、的影響
　　目的:
　　通過(guò)測(cè)定梗阻側(cè)腎臟tunel結(jié)果及Bcl-2與Bax及easepase-3蛋白的表達(dá)對(duì)雷帕霉素減輕腎間質(zhì)纖維化和腎功能保護(hù)的機(jī)理進(jìn)行初步探討
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型制備與分組給藥同第一部分。
　　2.大鼠殘余腎冰凍切片Tunel法染色觀測(cè)細(xì)胞凋亡活性
　　3.免疫組織化學(xué)法與Western Blot檢測(cè)Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白表達(dá)的方法
　　結(jié)果

11、:
　　1.組織凋亡活性
　　假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)僅見(jiàn)有少量凋亡細(xì)胞;UUO組、Rap組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞細(xì)胞，于第7天最多，第14天減少，二者明顯高于假手術(shù)組比，P＜0.05;與UUO組比較，Rap組明顯減少，P＜0.05。
　　2.各組大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　假手術(shù)組Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白于腎小管，腎間質(zhì)及腎小球僅有極少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)一致

12、，P＞0.05;在UUO組Bcl-2蛋白于術(shù)后第4天可見(jiàn)明顯表達(dá)，主要分布腎小管胞質(zhì)，腎間質(zhì)及腎小球僅見(jiàn)少量表達(dá)，第7天達(dá)高峰，第14天明顯下降;Rap組表達(dá)的時(shí)間與區(qū)域與UUO組一致，其染色強(qiáng)度及區(qū)域高于UUO組，P＜0.05;
　　Bax及casepase-3蛋白在UUO組、Rap組于術(shù)后第4天可見(jiàn)主要在腎小管尤其遠(yuǎn)端肥大或管腔增大的腎小管上皮細(xì)胞（Bax主要在胞質(zhì)，casepase-3主要在胞核）表達(dá)，腎間質(zhì)及腎小球皆亦見(jiàn)明

13、顯表達(dá)，于第7天達(dá)高峰，第14天下降，此時(shí)腎小球的表達(dá)量亦有所增加;但Rap組Bax及casepase-3蛋白染色強(qiáng)度及區(qū)域低于UUO組,P＜0.05。
　　3.Western Blot檢測(cè)Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的表達(dá)
　　各組大鼠蛋白在分子量為26kDa，22kDa及35kDa處依次可見(jiàn)Bcl-2、bax及Caspase-3條帶。Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白假手術(shù)組蛋白條帶淡，幾乎未見(jiàn)

14、明顯表達(dá)，于各時(shí)間點(diǎn)一致，與其他兩組相比其IOD值最低(P＜0.05);對(duì)Bcl-2蛋白條帶行進(jìn)行定量分析，在Rap組與UUO組，其蛋白表達(dá)量在時(shí)間變化上第7天最高，第14天最低，Rap組表達(dá)高于UUO組(P＜0.05); Bax、casepase-3蛋白R(shí)ap組及UUO組在各時(shí)間點(diǎn)上變化規(guī)律一致，于術(shù)后第7天達(dá)高峰，第14天下降，但表達(dá)量上仍高于第4天，UU0組Bax蛋白表達(dá)優(yōu)于Rap組(P＜0.05)。
　　結(jié)論: