人外周血樹突狀細胞的誘導及鑒定.pdf

1、樹突狀細胞（DC）是機體免疫系統(tǒng)非常重要的一類抗原提呈細胞，是目前已知的抗原提呈功能最強的專職APC，可啟動并調節(jié)免疫應答，刺激T、B淋巴細胞活化，在抗腫瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病發(fā)病過程中起重要作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DC還具有調節(jié)免疫反應、誘導免疫耐受的作用。 目的：在體外建立起一個穩(wěn)定的從人外周血單核細胞誘導未成熟及成熟DC的培養(yǎng)體系，經(jīng)流式細胞術檢測細胞表面分子的表達情況，并應用MTT法對培養(yǎng)細胞的功能進行

2、測定，從而確保獲得具有一定形態(tài)和功能特征的DC，為進一步探討DC在免疫耐受及抗腫瘤方面作用奠定基礎。 方法：采用塑料貼壁法從健康人外周血單個核細胞獲取單核細胞，第一階段在GM-CSF+IL-4因子組合聯(lián)合誘導下培養(yǎng)細胞5～7天，獲得未成熟DC；第二階段在GM-CSF+TNF-α因子組合聯(lián)合誘導下培養(yǎng)細胞至12～14天，獲得成熟的DC。對DC的形態(tài)進行觀察，流式細胞術檢測細胞表面CD14、CD83、CD1a、CD80、CD86、H

3、LA-DR、CD25分子的表達，采用吞噬中性紅的方法檢測未成熟DC的吞噬功能，再次混合淋巴細胞培養(yǎng)的方法觀察未成熟DC處理過的T細胞對與未成熟DC同一供者來源的T細胞的應答能力，測定DC在混合淋巴細胞反應中對異種T細胞的刺激作用，以及DC抑制腫瘤細胞生長的作用。 結果：用GM-CSF+IL-4 細胞因子聯(lián)合誘導培養(yǎng)48小時后出現(xiàn)呈半懸浮狀態(tài)的細胞，但未見細胞表面有明顯的突起，培養(yǎng)4～6天出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，散在分布在培養(yǎng)板中；加入TN

4、F-α誘導后，成簇現(xiàn)象明顯增多，呈現(xiàn)以樹枝狀不規(guī)則變化的貼壁細胞為底的圓形細胞集落，可以見到圓形、帶有毛刺狀突起的懸浮細胞，隨著時間的延長，成簇的細胞團散開，形態(tài)不規(guī)則的細胞減少，培養(yǎng)12天即可以看到多數(shù)細胞表面有明顯的毛刺狀突起， 14天時幾乎均為單個具有典型DC形態(tài)的懸浮細胞。未成熟DC中度表達CD1a、CD80、CD86、CD25分子，高表達HLA-DR分子，低表達CD83分子；成熟期中度表達CD1a分子，CD80、CD86、CD

5、25、HLA-DR及CD83分子均高表達；在DC的未成熟期與成熟期均中度以上表達CD14分子；DC隨著培養(yǎng)時間的不同內(nèi)吞能力在培養(yǎng)7天時達高峰，且內(nèi)吞能力強于相同培養(yǎng)時間的單核細胞（p＜0.05）；在再次混合淋巴細胞反應中，供者未成熟DC預處理的受者T細胞當再次被供者的T細胞刺激時應答降低，而對第三者的T細胞刺激則表現(xiàn)強的反應性。中度表達共刺激分子的未成熟DC在體外可以誘導T細胞免疫低應答。刺激同種異型T淋巴細胞增殖的能力強。具有抑制腫