間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法改良及其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的機(jī)制.pdf

1、目的：間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的干細(xì)胞。其在臨床上應(yīng)用廣泛，可用于治療GVHD（Graft-versus-host disease）、促進(jìn)造血重建等。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還可以抑制異種抗原刺激所致的淋巴細(xì)胞反應(yīng)、促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞生成等，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。并且，近期研究發(fā)現(xiàn)，其不但對特異性免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用，對非特異性免疫應(yīng)答細(xì)胞亦具有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，其可能參與“調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞”的形成，但是目前對其

2、作用機(jī)制尚不明確。間充質(zhì)干細(xì)胞已成為干細(xì)胞領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，但是目前常用的體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法容易導(dǎo)致其干性降低、細(xì)胞凋亡以及衰老。因此，本課題擬尋找一種可以維持間充質(zhì)干細(xì)胞干性，降低其凋亡、延緩衰老進(jìn)程的培養(yǎng)方法；并對其與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：將殼聚糖溶解于醋酸后涂覆于培養(yǎng)板表面，在60℃烘箱中完全烘干，形成殼聚糖薄膜。后將分離出的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以同等密度接種于涂覆有

3、殼聚糖的培養(yǎng)板和普通未經(jīng)處理的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)5天后收集兩組細(xì)胞檢測其干性相關(guān)標(biāo)志分子CD44、Sca-1的表達(dá)情況；分別用PI-Annexin V和Hochest33342進(jìn)行染色和標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分析和觀察細(xì)胞凋亡的情況；最后用β-Gal細(xì)胞衰老染色試劑盒進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的衰老情況。通過上述實(shí)驗(yàn)分析三維球體培養(yǎng)方式對間充質(zhì)干細(xì)胞干性、凋亡和衰老的影響。為了研究間充質(zhì)干細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制，我

4、們收集生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清，從中分離出外泌體并添加到樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基中，通過ELISA的方法檢測樹突狀細(xì)胞分泌的IL-10的情況。將與外泌體共培養(yǎng)48h后的樹突狀細(xì)胞與小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72h，之后用流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例以及分析T細(xì)胞增殖能力的變化。通過對樹突狀細(xì)胞分泌IL-10以及其激活T細(xì)胞能力的變化進(jìn)行分析，探討外泌體是否參與間充質(zhì)干細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
　　

5、結(jié)果：間充質(zhì)干細(xì)胞在殼聚糖薄膜上培養(yǎng)1天即開始出現(xiàn)聚集的趨勢，到第3天即呈半懸浮的三維球體狀態(tài)。通過各個實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三維球體狀態(tài)下生長的間充質(zhì)干細(xì)胞其干性相關(guān)分子CD44和Sca-1的表達(dá)比例要明顯高于對照組，很好的保持了其干性；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示的凋亡細(xì)胞比例以及在熒光顯微鏡
　　結(jié)論：間充質(zhì)干細(xì)胞近年來備受關(guān)注，目前在組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。但在目前的培養(yǎng)條件下容易過早的喪失干性、凋亡和衰老，從而嚴(yán)重影響其應(yīng)用