側柏葉、牡丹皮拮抗內毒素活性組分的制備及活性研究.pdf

1、目的：內毒素是革蘭陰性細菌外膜的重要組成部分，也是介導膿毒癥的重要病原分子，它由O-側鏈多糖、核心多糖和脂質A(LipidA)三部分組成，其中LipidA是革蘭陰性細菌最為保守的部位，也是LPS的活性中心[1]。LPS在膿毒癥發(fā)生過程中具有重要作用，因此，拮抗LPS是治療和預防由革蘭陰性細菌引起的膿毒癥的重要手段之一[2-13]；傳統(tǒng)中藥在拮抗內毒素方面積累了寶貴的經驗，醫(yī)學實踐證明，許多中藥在體內外都具有抗內毒素作用[14-15]，但

2、由于跟蹤手段的復雜性，限制了具有潛在抗內毒素活性中藥的深入研究，本課題利用本實驗室建立的生物傳感器檢測平臺，在前期工作基礎上，結合國內外文獻報道，選擇與LipidA具有較高結合活性的側柏葉、牡丹皮，進行拮抗內毒素活性組分的定向分離，并對所得到的活性組分進行體內外活性評價。 方法：(1)將LipidA包被于生物傳感器非衍生板，用不同濃度的多粘菌素B(PMB)測定與LipidA的平衡解離常數(shù)(KD)，以此建立中藥活性組分跟蹤檢測體系

3、。(2)利用生物傳感器，采用萃取、硅膠柱層析、聚酰胺層析、離子交換-HPLC等技術對側柏葉、牡丹皮進行活性組分的定向分離。(3)通過活性組分對LPS介導RAW264.7分泌細胞因子的抑制實驗、LPS體內外中和實驗及對LPS和熱滅活細菌攻擊小鼠的保護實驗，以評價所得活性組分對內毒素的拮抗作用。 結果：(1)用LipidA包被后的非衍生板(NDC)共振掃描峰成尖細對稱的單峰圖形，包被值為1994RU(arcsecond)，包被量約為

4、3.4ng/mm2，與PMB的平衡解離常數(shù)(KD)為5.59×10-8M，非衍生板的包被曲線、共振峰和KD值均符合實驗所需標準，可用于樣品的檢測。(2)利用生物傳感器、硅膠柱層析、聚酰胺層析等技術，從側柏葉水提取物中定向分離得到一個與LipidA高結合組分，該組分對致死劑量LPS攻擊的小鼠無顯著的保護作用(保護率為22.2％)，在小鼠體內對LPS無顯著的中和能力(中和率為33.4％)。(3)從牡丹皮水提取物中分離到一個與LipidA具有

5、較高結合活性的組分，該組分在體外能抑制LPS介導的RAW264.7細胞釋放TNF-α，對致死劑量LPS攻擊小鼠的保護率為44.4％，對致死劑量熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠的保護率為37.5％，與對照組比較，均具有顯著性差別。 結論：(1)從側柏葉中分離到一個與LipidA具有較高結合活性的組分，但對致死劑量LPS攻擊的小鼠并無明顯的保護作用，在小鼠體內也無顯著的LPS中和能力，提示與LipidA的結合作用只是拮抗LPS的第一步，結合后