側(cè)柏葉、牡丹皮拮抗內(nèi)毒素活性組分的制備及活性研究.pdf

1、目的：內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌外膜的重要組成部分，也是介導(dǎo)膿毒癥的重要病原分子，它由O-側(cè)鏈多糖、核心多糖和脂質(zhì)A(LipidA)三部分組成，其中LipidA是革蘭陰性細(xì)菌最為保守的部位，也是LPS的活性中心[1]。LPS在膿毒癥發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，因此，拮抗LPS是治療和預(yù)防由革蘭陰性細(xì)菌引起的膿毒癥的重要手段之一[2-13]；傳統(tǒng)中藥在拮抗內(nèi)毒素方面積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，醫(yī)學(xué)實(shí)踐證明，許多中藥在體內(nèi)外都具有抗內(nèi)毒素作用[14-15]，但

2、由于跟蹤手段的復(fù)雜性，限制了具有潛在抗內(nèi)毒素活性中藥的深入研究，本課題利用本實(shí)驗(yàn)室建立的生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)，在前期工作基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，選擇與LipidA具有較高結(jié)合活性的側(cè)柏葉、牡丹皮，進(jìn)行拮抗內(nèi)毒素活性組分的定向分離，并對(duì)所得到的活性組分進(jìn)行體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)。 方法：(1)將LipidA包被于生物傳感器非衍生板，用不同濃度的多粘菌素B(PMB)測(cè)定與LipidA的平衡解離常數(shù)(KD)，以此建立中藥活性組分跟蹤檢測(cè)體系

3、。(2)利用生物傳感器，采用萃取、硅膠柱層析、聚酰胺層析、離子交換-HPLC等技術(shù)對(duì)側(cè)柏葉、牡丹皮進(jìn)行活性組分的定向分離。(3)通過(guò)活性組分對(duì)LPS介導(dǎo)RAW264.7分泌細(xì)胞因子的抑制實(shí)驗(yàn)、LPS體內(nèi)外中和實(shí)驗(yàn)及對(duì)LPS和熱滅活細(xì)菌攻擊小鼠的保護(hù)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)所得活性組分對(duì)內(nèi)毒素的拮抗作用。 結(jié)果：(1)用LipidA包被后的非衍生板(NDC)共振掃描峰成尖細(xì)對(duì)稱的單峰圖形，包被值為1994RU(arcsecond)，包被量約為

4、3.4ng/mm2，與PMB的平衡解離常數(shù)(KD)為5.59×10-8M，非衍生板的包被曲線、共振峰和KD值均符合實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)，可用于樣品的檢測(cè)。(2)利用生物傳感器、硅膠柱層析、聚酰胺層析等技術(shù)，從側(cè)柏葉水提取物中定向分離得到一個(gè)與LipidA高結(jié)合組分，該組分對(duì)致死劑量LPS攻擊的小鼠無(wú)顯著的保護(hù)作用(保護(hù)率為22.2％)，在小鼠體內(nèi)對(duì)LPS無(wú)顯著的中和能力(中和率為33.4％)。(3)從牡丹皮水提取物中分離到一個(gè)與LipidA具有

5、較高結(jié)合活性的組分，該組分在體外能抑制LPS介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α，對(duì)致死劑量LPS攻擊小鼠的保護(hù)率為44.4％，對(duì)致死劑量熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠的保護(hù)率為37.5％，與對(duì)照組比較，均具有顯著性差別。 結(jié)論：(1)從側(cè)柏葉中分離到一個(gè)與LipidA具有較高結(jié)合活性的組分，但對(duì)致死劑量LPS攻擊的小鼠并無(wú)明顯的保護(hù)作用，在小鼠體內(nèi)也無(wú)顯著的LPS中和能力，提示與LipidA的結(jié)合作用只是拮抗LPS的第一步，結(jié)合后