拮抗細(xì)菌主要病原分子中藥的篩選及地骨皮抗炎組分的制備與活性研究.pdf

1、目的：膿毒癥是由感染因素介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、大手術(shù)后的常見并發(fā)癥，臨床死亡率高達(dá)50％-60％，至今尚無有效的治療手段。近年來大量研究證實(shí)，G<'->菌的月旨多糖/內(nèi)毒素(lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)、G+菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、G<'->菌和G<'+>菌所共有

2、的細(xì)菌基因組DNA(cytidine-phosphate-guanosine DNA，CpG DNA)是細(xì)菌介導(dǎo)膿毒癥的主要病原分子，上述三個病原分子中任何一個單一分子均可介導(dǎo)致死性膿毒癥的發(fā)生，因此，如能同時有效地拮抗上述三個主要的病原分子，膿毒癥的防治就有可能取得突破性進(jìn)展。 傳統(tǒng)中藥在拮抗膿毒癥方面積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，但由于缺乏有效跟蹤檢測手段，限制了具有潛在抗膿毒癥活性中藥的深入研究，本課題以介導(dǎo)細(xì)菌膿毒癥的三種主要病原分

3、子PGN、CpG DNA及l(fā)ipidA為靶點(diǎn)，應(yīng)用生物傳感器技術(shù)平臺，從114種抗炎中藥中篩選出與上述三種病原分子均具有高親和力的藥物，并以其中與病原分子具有較高親和力的中藥一地骨皮為研究對象，對其進(jìn)行活性組分的分離制備并對所制備的組分進(jìn)行初步的拮抗細(xì)菌膿毒癥的生物學(xué)活性研究。 方法：(1)將PGN及CpG DNA包被于生物素樣品池，將lipid A包被于非衍生樣品池，分別建立以PGN、CpGDNA及l(fā)ipidA為靶點(diǎn)的技術(shù)平臺

4、，對114種抗炎中藥水提物進(jìn)行篩選、評價其活性物質(zhì)含量，并評估出針對上述三種病原分子均具有較高結(jié)合活性的中藥；(2)利用生物傳感器跟蹤檢測技術(shù)、大孔吸附樹脂分離技術(shù)，從地骨皮中定向分離與PGN、CpG DNA及l(fā)ipid A均具有較高親和力的活性組分：在體外實(shí)驗(yàn)中，測定不同濃度活性組分與PGN、CpGDNA及l(fā)ipid A親和力；MTT法及CCK-8法檢測活性組分對RAW264.7細(xì)胞活力的影響；ELISA法檢測活性組分對PGN(2μg

5、/ml)、CpG DNA(10μg/ml)及LPS(100ng/ml)刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的抑制作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用尾靜脈注射致死劑量熱滅活大腸桿菌和熱滅活金黃色葡萄球菌，建立細(xì)菌膿毒癥小鼠模型，觀察活性組分對膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用。 結(jié)果：(1)包被后的樣品池其共振掃描峰均為尖銳對稱的單峰圖形，PGN包被的生物素板的包被量約為0.44 ng/mm<'2>，CpG DNA包被的生物素板的包被量約為0.

6、33ng/mm<'2>，lipidA包被的非衍生板(NDC)包被量約為1.19 ng/mm<'2>，結(jié)果均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，建立了以PGN、CpG DNA及l(fā)ipid A為靶點(diǎn)的篩選抗炎中藥的技術(shù)平臺。在114種中藥中，半枝蓮、草果、側(cè)柏葉、地骨皮等22種中藥與PGN、CpG DNA及l(fā)iDid A均具有具有較高的結(jié)合活性(RU>100 arc seconds)，其中側(cè)柏葉、石榴皮、地骨皮等7種中藥與PGN、CpG DNA及l(fā)ipid A特

7、異性結(jié)合的活性物質(zhì)含量較高(RU>100 arcseconds)；(2)利用生物傳感器技術(shù)、大孔吸附樹脂分離技術(shù)從地骨皮中定向分離得到一個與PGN、CpG DNA及l(fā)ipid A均具有較高結(jié)合活性的E組分。該組分經(jīng)MTT法測定對小鼠RAW264.7細(xì)胞活力無影響(≤400μg/ml)，經(jīng)CCK-8法測定也對小鼠RAW264.7細(xì)胞活力無影響(≤800μg/ml)；對PGN、CpG DNA及LPS刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α