L-精氨酸和姜黃素對(duì)糖尿病患者血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、本文旨在觀察糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者血清(diabeticserum，DS)對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells，EC)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率及培養(yǎng)上清一氧化氮(nitrogenmonoxidum，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)的影響及L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)和姜黃素(curcumin

2、e，CC)對(duì)DS誘導(dǎo)的EC損傷的保護(hù)作用，探討DS導(dǎo)致EC損傷的機(jī)制并為研發(fā)有效保護(hù)EC功能的新型藥物提供理論依據(jù)。 方法：1.建立細(xì)胞損傷模型。培養(yǎng)的ECV-304，加入10﹪DM無(wú)并發(fā)癥患者血清(DS1)、10﹪DM有并發(fā)癥患者血清(DS2)、10﹪健康人血清(HS)及10﹪生理鹽水(normalsodium，NS)，分別孵育30min、3h、3d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變、收集培養(yǎng)上清測(cè)定NO(NO3-/NO2-)

3、、MDA、LDH水平，MTT(四甲基偶氮噻唑藍(lán))法測(cè)定3d時(shí)細(xì)胞存活率。 2.藥物保護(hù)最佳濃度篩選。DS1組與DS2組比較各指標(biāo)無(wú)顯著差異，上清內(nèi)加入DS1作為DS處理組，然后立即加入阿托伐他汀(atovastatin，AT)(1、5、10μM)、L-Arg(0.5、1.0、1.5mM)、CC(5、10、15μM)和0.1﹪的二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，孵育3d，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

4、3.藥物干預(yù)研究。培養(yǎng)上清內(nèi)加入DS后立即加入篩選出最佳濃度的AT、L-Arg、CC分別孵育30min、3h、3d，觀察細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率、收集培養(yǎng)上清測(cè)定NO、MDA、LDH濃度。 結(jié)果：1.DS對(duì)EC的損傷效應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)，30min、3h時(shí)，各組間無(wú)明顯差異；3d時(shí)，NS和HS組細(xì)胞仍為多角形，結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻，呈單層鋪路石狀排列，DS1和DS2組細(xì)胞數(shù)目減少，部分變圓、皺縮、胞體碎裂，排列紊亂。細(xì)胞存

5、活率(﹪)，DS1(81.35±8.75，P＜0.05)、DS2(78.28±9.72，P＜0.01)較NS組(99.5±5.07)明顯降低。NO濃度(μM)，30min時(shí)，4組間無(wú)明顯變化(P＞0.05)；3h、3d時(shí)，DS1(49.09±4.33，P＜0.01；50.16±5.1，P＜0.01)和DS2(50.63±2.1，P＜0.01；47.91±1.22，P＜0.01)較NS組(65.14±4.63，69.46±2.07)明顯降

6、低。MDA濃度(μM)，30min時(shí)，4組間無(wú)明顯變化(P＞0.05)；3h、3d時(shí)，DS1(4.35±0.42，P＜0.01；4.59±0.34，P＜0.01)和DS2(4.89±0.15，P＜0.01；5.14±0.44，P＜0.01)較NS組(2.33±0.15，2.57±0.20)明顯升高。LDH活力(U/L)，30min時(shí)，4組間無(wú)明顯變化(P＞0.05)；3h、3d時(shí)，DS1(1008.0±85.2，P＜0.01；1970.

7、7±219.2，P＜0.05)和DS2(1970.7±219.2，P＜0.05；2224.7±255.7，P＜0.05)較NS組(754.7±26.1，1417.3±159.3)明顯升高。DS1組與DS2組比較3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 2.藥物濃度篩選。細(xì)胞存活率(﹪)，AT(1、5、10μM)(93.80±5.76，P＜0.05；107.00±4.69，P＜0.01；97.50±3.70，P＜0.01)、

8、L-Arg(0.5、1.0、1.5mM)(128.00±8.68，P＜0.01；143.00±6.58，P＜0.01；142.15±7.29，P＜0.01)、CC(10、15μM)(118.75±4.79，P＜0.01；105.25±4.27，P＜0.01)較DS組(81.35±8.75)明顯升高，其中AT10μM、L-Arg1.0mM、CC10μM具有最佳保護(hù)效應(yīng)。 3.藥物保護(hù)效應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)，30min、3h時(shí)，各組間無(wú)明

9、顯差異；3d時(shí)，DMSO、DS、AT組如DS對(duì)細(xì)胞損傷效應(yīng)中對(duì)DS1所述，L-Arg和CC組細(xì)胞形態(tài)接近正常細(xì)胞。細(xì)胞存活率(﹪)，30min、3h時(shí)，各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；3d時(shí)，AT(83.57±3.47，P＜0.05)、L-Arg(90.39±1.27，P＜0.01)和CC組(92.36±0.69，P＜0.01)較DS組(75.89±2.96)明顯升高，L-Arg、CC組與AT組比較明顯升高(P＜0.05)。NO水平(

10、μM)，30min時(shí)，各組間無(wú)明顯變化(P＞0.05)；3h、3d時(shí)，AT(59.76±5.08，P＜0.05；66.79±3.23，P＜0.01)、L-Arg(61.74±4.15，P＜0.01；59.76±4.20，P＜0.01)和CC組(61.56±4.59，P＜0.01；63.22±5.54，P＜0.01)較DS組(49.09±4.33，50.16±5.19)明顯升高。MDA濃度(μM)，30min時(shí)，各組間無(wú)顯著差異(P＞0.

11、05)；3h時(shí)，AT(3.26±0.42，P＜0.05)、L-Arg(3.01±0.63，P＜0.05)和CC組(3.20±0.38，P＜0.05)較DS組(4.35±0.42)明顯降低；3d時(shí)，AT(2.97±0.17，P＜0.01)和CC組(2.75±0.37，P＜0.01)較DS組(4.16±0.31)明顯下降，L-Arg組與DS組比較無(wú)明顯變化(P＞0.05)。LDH活力(U/L)，30min、3d時(shí)，各組間無(wú)明顯差異(P＞0.

12、05)；3h時(shí)，L-Arg(602.5±153.5，P＜0.05)和CC組(646.5±152.3，P＜0.05)較DS組(937.5±157.2)明顯降低，AT組與DS組比較無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 DMSO組與DS組比較，L-Arg、CC、AT組之間比較上清內(nèi)NO、MDA、LDH的水平在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 結(jié)論：DS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的ECV-304損傷模型建立成功，損傷機(jī)制可能為DS通過(guò)氧化應(yīng)激