內(nèi)源性腎上腺糖皮質(zhì)激素對(duì)血管炎癥反應(yīng)抑制作用的研究.pdf

1、目的：糖尿病是以血糖持續(xù)性升高為特征并常伴心血管并發(fā)癥的代謝性疾病。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病導(dǎo)致心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等的起始環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)已被確認(rèn)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。已有研究表明生理水平的腎上腺糖皮質(zhì)激素具有抗炎作用。其抗炎作用主要是通過(guò)增強(qiáng)核組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性，從而抑制促炎核因子AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最近的研究資料顯示氧化應(yīng)激使肺組織HDAC失活，取消了外源性腎上腺糖皮質(zhì)激素的抗炎

2、效應(yīng)。這些結(jié)果提示氧化應(yīng)激滅活HDAC，不僅能夠取消外源性腎上腺糖皮質(zhì)激素的抗炎作用，也可能削弱內(nèi)源性腎上腺糖皮質(zhì)激素的抗炎效應(yīng)。因此，這里將主要研究生理水平腎上腺糖皮質(zhì)激素對(duì)血管炎癥反應(yīng)的抑制作用（抗炎作用）；這種內(nèi)源性抗炎機(jī)制在糖尿病血管并發(fā)癥中的作用和意義；以及氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)源性抗炎機(jī)制受損的分子機(jī)制。 方法： 1．將180-220g雄性SD大鼠分為三組，分別給予RU486（腎上腺糖皮質(zhì)激素拮抗劑）、TSA（HDA

3、C抑制劑）和摘除雙側(cè)腎上腺處理后，腹腔注射LPS，取大鼠胸主動(dòng)脈提取組織蛋白，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量、NF-κB以及HDAC活性。 2．選用6-8周齡雄性C57/B6小鼠，腹腔注射佐鏈脲菌素（STZ），建立1型糖尿病小鼠模型。將糖尿病小鼠分為單純糖尿病組及抗氧化劑組，單純糖尿病組分別于2、4、8、12周處理，抗氧化劑組分別喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及聯(lián)合用藥

4、于10周處理，取小鼠血清及胸主動(dòng)脈，ELISA法檢測(cè)腎上腺糖皮質(zhì)激素含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1含量，ELISA法檢測(cè)NF-κB以及HDAC活性。 3．分別使用糖尿病8周小鼠，同齡正常對(duì)照組；糖尿病12周小鼠，同齡正常對(duì)照組；分別喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及聯(lián)合用藥10周糖尿病小鼠，糖尿病10周小鼠，取血管組織進(jìn)行石蠟切片和HE染色，觀察各組小鼠血管形

5、態(tài)學(xué)變化。 4．原代培養(yǎng)小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定后，用3-5代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別給予LPS（內(nèi)毒素）、氫化可的松、TSA等處理，取細(xì)胞上清液，EIL-SA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量、NF-κB以及HDAC活性。 結(jié)果： 1．經(jīng)LPS刺激的SD大鼠，其胸主動(dòng)脈內(nèi)IL-1β、IL-6和IL-10的含量以及NF-κB的活性均比正常對(duì)照組顯著升高；分別給予RU486、TSA以及摘除

6、雙側(cè)腎上腺處理再腹腔注射LPS，可見(jiàn)IL-1β、IL-6和IL-10的含量以及NF-κB的活性均比單純給予LPS顯著升高。預(yù)先給予RU486或者摘除雙側(cè)腎上腺處理對(duì)SD大鼠胸主動(dòng)脈組織中HDAC活性未見(jiàn)明顯影響；而預(yù)先給予TSA后，大鼠胸主動(dòng)脈中HDAC活性受到抑制。 2．糖尿病小鼠分別于2、4、8、12周處理，與正常對(duì)照組相比，血清腎上腺糖皮質(zhì)激素、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1水平均顯著增加，并且呈現(xiàn)出隨時(shí)間遞

7、增的趨勢(shì)；胸主動(dòng)脈NF-κB活性顯著升高，HDAC活性下降，但未表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。 3．糖尿病小鼠分別喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及聯(lián)合用藥于10周處理，與正常對(duì)照組相比，各抗氧化劑對(duì)不同細(xì)胞因子表現(xiàn)出不同作用：Tempol、Apocynin均引起血清IL-6、IFN-Y、TNF-α水平顯著下降，對(duì)MCP-1表達(dá)未見(jiàn)明顯影響；Allopurinol引起IFN-γ含量降低，IL-6、TNF-α

8、含量升高，對(duì)MCP-1表達(dá)未見(jiàn)明顯影響；聯(lián)合用藥引起IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1表達(dá)均大幅度下降，但死亡率很高，存活例數(shù)不足。各抗氧化劑均能引起胸主動(dòng)脈NF-κB的活性不同程度降低，而胸主動(dòng)脈HDAC活性不同程度的升高。 結(jié)論： 1．分別阻斷糖皮質(zhì)激素受體、抑制HDAC活性和摘除雙側(cè)腎上腺，均可見(jiàn)SD大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的含量以及促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性均明顯增加，提

9、示內(nèi)源性的腎上腺糖皮質(zhì)激素對(duì)血管炎癥反應(yīng)具有抑制作用。 2．糖尿病小鼠血清腎上腺糖皮質(zhì)激素水平、細(xì)胞因子如IL-6、IFN-γ、TNF-α等水平以及胸主動(dòng)脈NF-κB活性均顯著升高，而胸主動(dòng)脈內(nèi)HDAC活性降低；應(yīng)用抗氧化劑后，細(xì)胞因子水平以及NF-κB表達(dá)下降，而HDAC活性增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，HDAC是內(nèi)源性腎上腺糖皮質(zhì)激素抑制血管炎癥反應(yīng)的重要途徑；糖尿病時(shí)，體內(nèi)腎上腺糖皮質(zhì)激素升高，但是由于氧化應(yīng)激抑制了血管HDAC活性，內(nèi)