α7煙堿受體在糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、研究背景:
　　小膠質(zhì)細(xì)胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞,其持續(xù)激活可引起腦內(nèi)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng),并導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(Glucocoticoids,GCs)介導(dǎo)的體液抗炎通路在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,小膠質(zhì)細(xì)胞上可高表達(dá)糖皮質(zhì)激素受體(Glucocoticoid receptor,GR),是GCs的直接抗炎靶標(biāo)。α7煙堿型乙酰膽堿受體(alpha7 nicotinic acetylcholine rece

2、ptor,α7nAChR)作為一種新的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制—膽堿能神經(jīng)抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)的關(guān)鍵分子,亦大量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞α7nAChR與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān),激動(dòng)α7nAChR可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),表明小膠質(zhì)細(xì)胞α7nAChR介導(dǎo)的抗炎作用是機(jī)體調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的另一重要機(jī)制。作為機(jī)體內(nèi)兩條重要的內(nèi)源性抗炎通路,生理濃度GCs與CAP通路在腦內(nèi)炎癥

3、調(diào)節(jié)中的關(guān)系如何,兩者之間是否存在關(guān)聯(lián),對(duì)該類問(wèn)題的研究尚未有報(bào)道。小膠質(zhì)細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)GR和α7nAChR,可作為體液和CAP通路的共同抗炎靶標(biāo),且對(duì)神經(jīng)元的研究表明,GCs可以調(diào)節(jié)α7nAChR表達(dá)。這些證據(jù)均提示GCs可能通過(guò)CAP通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。因此,本研究擬利用小膠質(zhì)細(xì)胞探討 GCs介導(dǎo)的體液抗炎通路與α7nAChR介導(dǎo)的CAP通路之間的關(guān)系,進(jìn)一步揭示腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　目的:
　　探

4、討小膠質(zhì)細(xì)胞α7nAChR在生理濃度糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的作用,揭示體液與膽堿能抗炎通路之間的關(guān)系,并初步闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)藥物選用糖皮質(zhì)激素類中的氫化可的松(Hydrocortisone,Hydr),其生理濃度范圍為110-520nM。MTT法檢測(cè)不同濃度Hydr對(duì)bv-2小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激bv-2小膠質(zhì)細(xì)胞造成炎癥模型。在建立炎癥模型

5、的基礎(chǔ)上,分為空白對(duì)照組、LPS組、Hydr+LPS組,ELISA方法檢測(cè)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β釋放水平,觀察高濃度和生理濃度Hydr對(duì)其的影響;其次,加入α7nAChR拮抗劑甲基牛扁亭堿(Methyllycaconitine,MLA),分為空白對(duì)照組、LPS組、Hydr(300nM)+LPS組、MLA(10nM)+Hydr(300nM)+LPS組,使用ELISA方法檢測(cè)炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β釋放水平,并觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形

6、態(tài)學(xué)的變化情況,以探索生理濃度 Hydr是否通過(guò)α7nAChR在抗炎中起作用;最后,分為空白對(duì)照組、Hydr組、MLA+Hydr組,采用RT-PCR檢測(cè)Hydr對(duì)α7nAChR、GR mRNA表達(dá)的影響,Western blot檢測(cè)Hydr對(duì)α7nAChR蛋白質(zhì)水平的影響,探討體液抗炎與膽堿能抗炎之間的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　1.生理濃度的糖皮質(zhì)激素對(duì)LPS誘致炎癥反應(yīng)的抑制作用:
　　(1) MTT結(jié)果顯示,與空白組

7、相比,2000nM Hydr可使細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01),1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM的Hydr對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。
　　(2)經(jīng)LPS刺激,bv-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的含量隨著刺激濃度的增加和刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸遞增,呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性的關(guān)系;經(jīng)不同濃度的Hydr給藥預(yù)作用后,生理濃度范圍(110-520nM)內(nèi)Hydr(500,250nM)可顯著降

8、低TNF-α、IL-1β的生成量(P<0.01,P<0.05)。
　　2.α7nAChR在介導(dǎo)生理濃度的糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)中的作用:
　　(1) Hydr(300nM)可顯著降低TNF-α、IL-1β的生成量(P<0.01),這一作用可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA(10nM)拮抗(P<0.01,P<0.05)。
　　(2) Hydr(300nM)可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞bv-2的激活,減少細(xì)胞分枝和偽足的生成,而

9、這一作用同樣可被α7nAChR特異性拮抗劑MLA(10nM)拮抗。
　　3.生理濃度的糖皮質(zhì)激素對(duì)α7nAChR和GR受體的調(diào)控情況:
　　(1) Hydr(300nM)可增加bv-2細(xì)胞α7nAChR mRNA表達(dá),這一作用同樣可被MLA(10nM)拮抗。
　　(2) Hydr(300nM)可增加bv-2細(xì)胞GR mRNA表達(dá)。MLA(10nM)對(duì)這一作用無(wú)拮抗。
　　(3) Hydr(300nM)可增加bv-