革蘭陰性桿菌中新耐藥基因和耐藥機制的發(fā)現(xiàn)和研究.pdf

1、革蘭陰性桿菌是目前臨床最常見的致病菌，而且其耐藥性日益嚴重。本文對第三代頭孢菌素和氟喹諾酮同時耐藥的志賀菌、多重耐藥的非01、非0139霍亂弧菌、對哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制劑抗菌藥物，以及頭孢哌酮耐藥而對頭孢噻肟敏感的大腸埃希菌等菌株進行了研究，并把耐藥基因與其遺傳環(huán)境有機地聯(lián)系起來，研究其耐藥性轉(zhuǎn)移的機制。 一、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶福氏志賀菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrS的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：明確一株對第三代頭孢

2、菌素和氟喹諾酮同時耐藥的福氏志賀菌的分子機制，了解質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因的結(jié)構(gòu)特征。 方法：通過接合試驗了解耐藥性是否由質(zhì)粒介導(dǎo)；用PER分別擴增染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因并進行序列分析，檢測染色體介導(dǎo)耐藥的突變位點和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥的基因型；用PER擴增CTX-M各組ESBLs基因并進行序列分析，檢測RJ506所攜帶ESBL的基因型；對耐藥質(zhì)粒進行“鳥槍法”隨機克隆實驗并對插入到克隆載體pACYC184的EcoRI酶切片斷進

3、行測序，檢測和分析qnrS基因的上下游結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：RJ506染色體DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA亞基的83位發(fā)現(xiàn)Ser→Leu突變，而gyrB和pare未見突變；ESBLs基因blaCTX-M-3和喹諾酮耐藥基因qnrS分別位于可接合質(zhì)粒上；qnrS及其上下游序列的基因結(jié)構(gòu)為“blaLAp-qnrS保守區(qū)域-CS12-fgc-like的形式。 結(jié)論：本實驗首次在國內(nèi)的志賀菌中檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrS和CTX-M-3型

4、ESBL，后者介導(dǎo)了細菌對第三代頭孢菌素的耐藥，前者可介導(dǎo)細菌對萘啶酸的耐藥，而且其與DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA亞基83位Ser→Leu突變的聯(lián)合作用可導(dǎo)致細菌對環(huán)丙沙星的耐藥；qnrS的起源和擴散可能與插入序列IS有關(guān)，其上下游的基因結(jié)構(gòu)主要有兩種形式，而我國檢出的菌株上述基因結(jié)構(gòu)完全相同。 二、非01、非0139霍亂弧菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(PER-1)的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：是明確非01、非0139霍亂弧菌中ESBL的基因型

5、及其遺傳背景，以探討該耐藥基因傳播的機制。 方法：通過表型確證試驗確定細菌是否產(chǎn)生ESBL，通過接合試驗了解ESBL是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過PCR擴增和序列分析確定ESBL的基因型，通過反向PCR和序列分析了解ESBL基因兩側(cè)的結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：ESBL表型確證試驗確認菌株RJ354為產(chǎn)ESBL菌株，接合試驗證實ESBL基因位于可接合質(zhì)粒上，PCR、反向PCR擴增和序列分析確定其基因型為blaPER-1，該基因上游序列為ORF5

6、13，下游為gst-like基因。 結(jié)論：首次在世界范圍內(nèi)從非01、非0139霍亂弧菌中檢出了ESBL-PER-1，而且首次發(fā)現(xiàn)該酶基因與一種新的基因元件ISCR1相連，后者可能介導(dǎo)前者的水平轉(zhuǎn)移。 三、兩種新的耐藥基因dfrA27(對甲氧芐啶耐藥)和adaA16(對鏈霉素/壯觀霉素耐藥)的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：確定菌株RJ354中整合子的種類及整合子所攜帶基因盒的特征。 方法：通過PCR擴增檢測不同種類的整

7、合酶；用長片斷PCR對整合子可變區(qū)全序列進行擴增，序列分析了解基因盒的數(shù)量和基因種類；通過pMD18-TSimpleVector載體分別對整合子全長PCR產(chǎn)物和adaA基因盒進行TA克隆和表達。 結(jié)果：菌株RJ354及其接合子均含有1類整合子，其可變區(qū)包含三個基因盒，其中的基因分別為arr-3和兩種新的基因，這兩種新基因所編碼的蛋白分別與DfrA5和AdaA6具有75％和88％的一致性，整合子全長PCR產(chǎn)物TA克隆株表現(xiàn)為對利福

8、平、甲氧芐啶和鏈霉素/壯觀霉素耐藥，反向、正向插入載體的adaA基因盒TA克隆株均表現(xiàn)為對鏈霉素/壯觀霉素耐藥。 結(jié)論：本試驗在世界上首次發(fā)現(xiàn)了兩種新的耐藥基因dfrA27(甲氧芐啶耐藥)和adaA16(鏈霉素/壯觀霉素耐藥)，它們位于可接合質(zhì)粒上1類整合子的基因盒中，而且adaA16基因盒含有獨立的啟動子序列。 四、TEM-1β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的大腸埃希菌對哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮耐藥機制的研究 目的：探討臨

9、床分離大腸埃希菌RJ904對哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制劑抗菌藥物和頭孢哌酮的耐藥機制。 方法：通過三相水解試驗了解酶的水解特性，通過接合試驗了解耐藥性是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過“鳥槍法”隨機克隆實驗將耐藥質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的片段插入到克隆載體pACYC184中表達并二、非01、非0139霍亂弧菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(PER-1)的發(fā)現(xiàn)和研究。本實驗的目的是明確非01、非0139霍亂弧菌中ESBL的基因型及其遺傳背景

10、，以探討該耐藥基因傳播的機制。通過表型確證試驗確定細菌是否產(chǎn)生ESBL，通過接合試驗了解ESBL是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過PCR擴增和序列分析確定ESBL的基因型，通過反向PCR和序列分析了解ESBL基因兩側(cè)的結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：ESBL表型確證試驗確認菌株RJ354為產(chǎn)ESBL菌株，接合試驗證實ESBL基因位于可接合質(zhì)粒上，PCR、反向PCR擴增和序列分析確定其基因型為blaPER-1，該基因上游序列為ORF513，下游為gst-like