革蘭陰性桿菌中新耐藥基因和耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和研究.pdf

1、革蘭陰性桿菌是目前臨床最常見(jiàn)的致病菌，而且其耐藥性日益嚴(yán)重。本文對(duì)第三代頭孢菌素和氟喹諾酮同時(shí)耐藥的志賀菌、多重耐藥的非01、非0139霍亂弧菌、對(duì)哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制劑抗菌藥物，以及頭孢哌酮耐藥而對(duì)頭孢噻肟敏感的大腸埃希菌等菌株進(jìn)行了研究，并把耐藥基因與其遺傳環(huán)境有機(jī)地聯(lián)系起來(lái)，研究其耐藥性轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 一、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶福氏志賀菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrS的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：明確一株對(duì)第三代頭孢

2、菌素和氟喹諾酮同時(shí)耐藥的福氏志賀菌的分子機(jī)制，了解質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因的結(jié)構(gòu)特征。 方法：通過(guò)接合試驗(yàn)了解耐藥性是否由質(zhì)粒介導(dǎo)；用PER分別擴(kuò)增染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因并進(jìn)行序列分析，檢測(cè)染色體介導(dǎo)耐藥的突變位點(diǎn)和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥的基因型；用PER擴(kuò)增CTX-M各組ESBLs基因并進(jìn)行序列分析，檢測(cè)RJ506所攜帶ESBL的基因型；對(duì)耐藥質(zhì)粒進(jìn)行“鳥(niǎo)槍法”隨機(jī)克隆實(shí)驗(yàn)并對(duì)插入到克隆載體pACYC184的EcoRI酶切片斷進(jìn)

3、行測(cè)序，檢測(cè)和分析qnrS基因的上下游結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：RJ506染色體DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA亞基的83位發(fā)現(xiàn)Ser→Leu突變，而gyrB和pare未見(jiàn)突變；ESBLs基因blaCTX-M-3和喹諾酮耐藥基因qnrS分別位于可接合質(zhì)粒上；qnrS及其上下游序列的基因結(jié)構(gòu)為“blaLAp-qnrS保守區(qū)域-CS12-fgc-like的形式。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次在國(guó)內(nèi)的志賀菌中檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrS和CTX-M-3型

4、ESBL，后者介導(dǎo)了細(xì)菌對(duì)第三代頭孢菌素的耐藥，前者可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)萘啶酸的耐藥，而且其與DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA亞基83位Ser→Leu突變的聯(lián)合作用可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥；qnrS的起源和擴(kuò)散可能與插入序列IS有關(guān)，其上下游的基因結(jié)構(gòu)主要有兩種形式，而我國(guó)檢出的菌株上述基因結(jié)構(gòu)完全相同。 二、非01、非0139霍亂弧菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(PER-1)的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：是明確非01、非0139霍亂弧菌中ESBL的基因型

5、及其遺傳背景，以探討該耐藥基因傳播的機(jī)制。 方法：通過(guò)表型確證試驗(yàn)確定細(xì)菌是否產(chǎn)生ESBL，通過(guò)接合試驗(yàn)了解ESBL是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)PCR擴(kuò)增和序列分析確定ESBL的基因型，通過(guò)反向PCR和序列分析了解ESBL基因兩側(cè)的結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：ESBL表型確證試驗(yàn)確認(rèn)菌株RJ354為產(chǎn)ESBL菌株，接合試驗(yàn)證實(shí)ESBL基因位于可接合質(zhì)粒上，PCR、反向PCR擴(kuò)增和序列分析確定其基因型為blaPER-1，該基因上游序列為ORF5

6、13，下游為gst-like基因。 結(jié)論：首次在世界范圍內(nèi)從非01、非0139霍亂弧菌中檢出了ESBL-PER-1，而且首次發(fā)現(xiàn)該酶基因與一種新的基因元件ISCR1相連，后者可能介導(dǎo)前者的水平轉(zhuǎn)移。 三、兩種新的耐藥基因dfrA27(對(duì)甲氧芐啶耐藥)和adaA16(對(duì)鏈霉素/壯觀霉素耐藥)的發(fā)現(xiàn)和研究 目的：確定菌株RJ354中整合子的種類(lèi)及整合子所攜帶基因盒的特征。 方法：通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)不同種類(lèi)的整

7、合酶；用長(zhǎng)片斷PCR對(duì)整合子可變區(qū)全序列進(jìn)行擴(kuò)增，序列分析了解基因盒的數(shù)量和基因種類(lèi)；通過(guò)pMD18-TSimpleVector載體分別對(duì)整合子全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物和adaA基因盒進(jìn)行TA克隆和表達(dá)。 結(jié)果：菌株RJ354及其接合子均含有1類(lèi)整合子，其可變區(qū)包含三個(gè)基因盒，其中的基因分別為arr-3和兩種新的基因，這兩種新基因所編碼的蛋白分別與DfrA5和AdaA6具有75％和88％的一致性，整合子全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物TA克隆株表現(xiàn)為對(duì)利福

8、平、甲氧芐啶和鏈霉素/壯觀霉素耐藥，反向、正向插入載體的adaA基因盒TA克隆株均表現(xiàn)為對(duì)鏈霉素/壯觀霉素耐藥。 結(jié)論：本試驗(yàn)在世界上首次發(fā)現(xiàn)了兩種新的耐藥基因dfrA27(甲氧芐啶耐藥)和adaA16(鏈霉素/壯觀霉素耐藥)，它們位于可接合質(zhì)粒上1類(lèi)整合子的基因盒中，而且adaA16基因盒含有獨(dú)立的啟動(dòng)子序列。 四、TEM-1β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的大腸埃希菌對(duì)哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮耐藥機(jī)制的研究 目的：探討臨

9、床分離大腸埃希菌RJ904對(duì)哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制劑抗菌藥物和頭孢哌酮的耐藥機(jī)制。 方法：通過(guò)三相水解試驗(yàn)了解酶的水解特性，通過(guò)接合試驗(yàn)了解耐藥性是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)“鳥(niǎo)槍法”隨機(jī)克隆實(shí)驗(yàn)將耐藥質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的片段插入到克隆載體pACYC184中表達(dá)并二、非01、非0139霍亂弧菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(PER-1)的發(fā)現(xiàn)和研究。本實(shí)驗(yàn)的目的是明確非01、非0139霍亂弧菌中ESBL的基因型及其遺傳背景

10、，以探討該耐藥基因傳播的機(jī)制。通過(guò)表型確證試驗(yàn)確定細(xì)菌是否產(chǎn)生ESBL，通過(guò)接合試驗(yàn)了解ESBL是否由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)PCR擴(kuò)增和序列分析確定ESBL的基因型，通過(guò)反向PCR和序列分析了解ESBL基因兩側(cè)的結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：ESBL表型確證試驗(yàn)確認(rèn)菌株RJ354為產(chǎn)ESBL菌株，接合試驗(yàn)證實(shí)ESBL基因位于可接合質(zhì)粒上，PCR、反向PCR擴(kuò)增和序列分析確定其基因型為blaPER-1，該基因上游序列為ORF513，下游為gst-like