革蘭陰性超級細(xì)菌碳青霉烯酶基因和可移動耐藥元件結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、目的：近年來，隨著碳青霉烯類藥物的大量廣泛使用，碳青霉烯耐藥的革蘭陰性超級細(xì)菌檢出率越來越高，成為臨床感染治療面臨的重要難題，其耐藥機(jī)制研究已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制復(fù)雜，其中產(chǎn)能滅活碳青霉烯類抗生素的碳青霉烯酶是最重要的原因。細(xì)菌耐藥性迅速產(chǎn)生及擴(kuò)散的最主要原因是耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，耐藥基因得以在同種或不同種屬的細(xì)菌間廣泛傳播是通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，如接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子或插入序列共同區(qū)（ISCR）等可水

2、平轉(zhuǎn)移的基因元件。目前國內(nèi)外的研究，主要集中在可攜帶多種耐藥基因盒的整合子和可攜帶多種耐藥基因盒且傳播能力更強(qiáng)的插入序列共同區(qū)（ISCR1）上。本研究主要對臨床分離的G-桿菌超級細(xì)菌進(jìn)行常見碳青霉烯酶基因檢測，對常見可移動耐藥元件Ⅰ類整合子和ISCR1進(jìn)行檢測，了解他們在超級細(xì)菌中的分布及結(jié)構(gòu)特征，探討超級細(xì)菌的耐藥機(jī)制。對重要菌株如NDM和KPC型的超級細(xì)菌進(jìn)行基因定位分析，并對KPC型超級細(xì)菌進(jìn)行MLST和基因環(huán)境分析，以了解耐藥基

3、因水平轉(zhuǎn)移方式。另外，本研究特別針對兩個(gè)水解譜廣、水解功能強(qiáng)的重要基因NDM和KPC，建立一種快速、敏感、特異的雙重?zé)晒舛縋CR方法，能在單一體系同時(shí)檢測NMD和KPC。
　　 方法：⑴菌株選取和藥敏實(shí)驗(yàn)及模板DNA制備收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2011年7月至2012年7月臨床分離的來自不同科室不同標(biāo)本類型的耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。所有菌株的鑒定和藥敏試驗(yàn)是利用BD100全自動細(xì)

4、菌鑒定儀完成。對收集的菌株用SDS裂解，蛋白酶K消化，酚-氯仿提取，醋酸鈉-乙醇沉淀的方法提取細(xì)菌的全基因組DNA。⑵常見碳青霉烯酶基因檢測利用普通PCR方法對所有菌株進(jìn)行7種常見碳青霉烯酶基因KPC、NDM、VIM、IMP、SPM、GES、OXA-48，對于鮑曼不動桿菌特別加測OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like四群OXA類的碳青霉烯酶基因。對陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證并確定其

5、亞型。對NDM或KPC的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增16S核糖體基因序列并測序，以保證屬種鑒定的準(zhǔn)確。⑶耐藥基因播散方式研究為對NDM和KPC基因進(jìn)行定位，對NDM或KPC陽性的菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)以探討該耐藥基因的播散方式。特別對產(chǎn)KPC的菌株進(jìn)行MLST分型和基因環(huán)境研究，以和國內(nèi)外已報(bào)道情況進(jìn)行比較。⑷常見耐藥元件結(jié)構(gòu)研究利用PCR分別擴(kuò)增Ⅰ類整合子和ISCR1的保守區(qū)，陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增二者的可變區(qū)，利用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和Rsa

6、Ⅰ酶切可變區(qū)，根據(jù)酶切圖譜進(jìn)行初步分類，不同的酶切譜型挑選2株進(jìn)行可變區(qū)測序，分析序列的同源性得出耐藥基因盒組合。對同時(shí)攜帶整合子和ISCR1的菌株擴(kuò)增其串聯(lián)區(qū)，以驗(yàn)證是否為復(fù)雜性Ⅰ類整合子并通過測序得到復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)。⑸NDM和KPC基因雙重qPCR法的建立將已知的NDM和KPC基因所有亞型序列分別進(jìn)行同源性比對，找出保守區(qū)進(jìn)行引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)。分別構(gòu)建NDM和KPC基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以該標(biāo)準(zhǔn)品對雙重qPCR體系進(jìn)行優(yōu)化

7、。質(zhì)粒定量后經(jīng)過一系列10倍梯度稀釋，使其濃度為108copies/μl～101copies/μl，采用優(yōu)化好的雙重體系評價(jià)該方法的敏感性和線性關(guān)系。同時(shí)選取105copies/μ濃度的質(zhì)粒連續(xù)三天重復(fù)檢測，每次做三個(gè)復(fù)孔，通過計(jì)算各自CT值的變異系數(shù)進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性的評價(jià)。利用不含目的基因的標(biāo)準(zhǔn)株（大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923）對該方法

8、進(jìn)行特異性評價(jià)。對經(jīng)普通PCR和測序驗(yàn)證NDM和KPC基因已知的220株臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌（200株碳青霉烯敏感株和20株非敏感株），利用已建立的雙重qPCR方法進(jìn)行檢測，比較與普通PCR檢測結(jié)果的符合率。
　　 結(jié)果：①碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果16株碳青霉烯耐藥腸桿菌科超級細(xì)菌中:10株攜帶NDM-1基因包括4株陰溝腸桿菌、3株肺炎克雷伯菌、1株產(chǎn)酸克雷伯菌、1株產(chǎn)氣腸桿菌和1株霍氏腸桿菌（國際首次發(fā)現(xiàn)）;1株產(chǎn)氣腸桿菌攜帶

9、IMP-4基因;1株肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶IMP-4基因和KPC-2基因;另外4株菌所有檢測的碳青霉烯酶基因均陰性。811株菌共檢出6種碳青霉烯酶基因，具體為:鮑曼不動桿菌中碳青霉烯敏感組25株攜帶OXA-23-like、139株攜帶OXA-51-like、6株攜帶OXA-58-like;非敏感組129株攜帶OXA-23-like、2株攜帶OXA-24-like、126株攜帶OXA-51-like、15株攜帶OXA-58-like;銅綠假

10、單胞菌碳青霉烯敏感組4株攜帶IMP，非敏感組33株攜帶IMP、10株攜帶VIM。其中鮑曼不動桿菌中48株OXA-23-like和OXA-51-like共存;1株OXA-24-like和OXA-51-like共存;14株OXA-58-like和OXA-51-like共存。兩屬種獲得性碳青霉烯酶在敏感組和非敏感組間攜帶率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，非敏感組均高于敏感組。②重要基因水平播散方式研究10株NDM陽性的菌株4株成功地將NDM-1耐藥基因轉(zhuǎn)移給

11、受體菌，進(jìn)一步分析質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)霍氏腸桿菌攜帶的復(fù)雜性Ⅰ類整合子與NDM-1基因共存于同一個(gè)接合性質(zhì)粒上。肺炎克雷伯菌Car11攜帶的KPC-2基因位于接合性質(zhì)粒，但I(xiàn)MP-4并不位于此質(zhì)粒。對產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌進(jìn)行MLST分析發(fā)現(xiàn)為ST530，這種罕見的ST序列型為國際首次報(bào)道。③Ⅰ類整合子檢測結(jié)果16株菌中共有10株整合酶擴(kuò)增陽性，進(jìn)一步擴(kuò)增整合子可變區(qū)發(fā)現(xiàn)10株均陽性。整合子可變區(qū)陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示這10株菌共攜帶5種不

12、同類型的基因盒，具體為:肺炎克雷伯菌Car1、產(chǎn)酸克雷伯菌Car4和產(chǎn)氣腸桿菌Car12共3株菌攜帶aar-3+dffA27基因盒;陰溝腸桿菌Car5-8共4株攜帶aadB+aadA1基因盒;霍氏腸桿菌Car9攜帶dfrA16+aadA2基因盒;陰溝腸桿菌Car14攜帶arr3+aadA1基因盒;肺炎克雷伯菌Car16攜帶dfrA17+aadA5基因盒。391株鮑曼不動桿菌中230株菌整合子擴(kuò)增陽性共攜帶6種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子，

13、其中碳青霉烯碳青霉烯非敏感組中135株(78.4％)陽性，敏感組中95(43.4％)株陽性，兩組間攜帶率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，非敏感組明顯高于敏感組。420株銅綠假單胞菌60株攜帶共14種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子，其中敏感組14株(6.3％)，非敏感組46株陽性，兩組間攜帶率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體為:164株aacA4+catB8+aadA1,48株aacC1+orfP+orfP,12株arr-3+aacA4,1株blaPSE,3株dfrA17+

14、aadA5，2株aacA4。420株銅綠假單胞菌60株攜帶共14種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子。具體為:9株aacA4+aadA2，3株aadA1，aadA2、cmlA1+aadA2、tetR、oxa-10各1株，aadA4、aacA4各5株，aadB+cmlA6、aadA7、dfrA17+aadA5各4株，13株aadB+blaPSE-1，2株IMP-9+aadA2，7株aacA4+catB8+aadA1。④ISCR1檢測結(jié)果16株腸桿

15、菌科超級細(xì)菌ISCR1保守區(qū)擴(kuò)增8株有目的條帶擴(kuò)增，進(jìn)一步擴(kuò)增ISCR1可變區(qū)發(fā)現(xiàn)這8(50％)株菌均陽性，陽性的可變區(qū)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示共存在3種不同的可變區(qū)類型，具體結(jié)果如下:肺炎克雷伯菌Car1、16和產(chǎn)氣腸桿菌Car12-13及霍氏腸桿菌Car9共5株ISCR1結(jié)構(gòu)排列為ISCR1+qnrA1+ampR+qacE△1;產(chǎn)酸克雷伯菌Car4 ISCR1結(jié)構(gòu)排列為ISCR1+short chain dehydrogenase/r

16、eductase+qnrB6+qacE△1;產(chǎn)氣腸桿菌Car10和肺炎克雷伯菌Car15共2株ISCR1結(jié)構(gòu)排列為ISCR1+sapA+qnrB2+qacE△1。811株非發(fā)酵菌中共185株ISCR1可變區(qū)陽性，鮑曼不動桿菌共162株陽性，其中碳青霉烯敏感組72(32.9％)株陽性，非敏感組90(52.3％)株陽性，二組間攜帶率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，非敏感組明顯高于敏感組;銅綠假單胞菌共23株陽性，其中碳青霉烯敏感組9(4.1％)株陽性，非敏感

17、組14(7.1％)株陽性，二組間攜帶率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有的ISCR1為同一個(gè)類型，測序結(jié)果顯示ISCR1與blaPER-1、GST-like、ABC transporter基因相連。⑤復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)腸桿菌科超級細(xì)菌中4株Ⅰ類整合子和ISCR1共存的菌株經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)兩株攜帶復(fù)雜性Ⅰ類整合子，具體為霍氏腸桿菌Car9攜帶intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul;產(chǎn)氣腸桿菌

18、Car12攜帶intI1+aar-3+dfrA27+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul。鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌均存在一種同樣排列組合形式的復(fù)雜性整合子 intI1+aacA4+catB8+aadA1+qacdelsul+ISCR1+blaPER-1+GST-like+ABCtransporter+qacdelsul，具體為:鮑曼不動桿菌碳青霉烯敏感組53(24.2％)株陽性，非敏感組73(42.

19、4％)株陽性，兩組間攜帶率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，非敏感組高于敏感組，而銅綠假單胞菌碳青霉烯敏感組1(0.5％)株陽性，非敏感組3(1.5％)株陽性，兩組間攜帶率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑥雙重qPCR利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化的雙重?zé)晒舛縋CR體系來擴(kuò)增一系列不含NDM和KPC基因的標(biāo)準(zhǔn)株，在NDM和KPC檢測通道均未見擴(kuò)增曲線，證明其特異性好。兩種種質(zhì)粒在108～101copies范圍內(nèi)都有很好的線性關(guān)系，最低均能檢測到10個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒。NDM和KPC重組質(zhì)

20、粒在105拷貝數(shù)的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5％，說明本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好。對220株經(jīng)普通PCR擴(kuò)增和測序驗(yàn)證標(biāo)本采用已建立的雙重qPCR體系進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與普通PCR結(jié)果完全符合。
　　 結(jié)論：⑴國際首次在霍氏腸桿菌中檢出NDM-1基因，并且該基因與基因盒排列為intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul的復(fù)雜性Ⅰ類整合子共

21、存于同一接合性質(zhì)粒上，這種共存模式也為首次報(bào)道。國際首次在肺炎克雷伯菌的一種新的序列型ST530中同時(shí)檢出KPC-2和IMP-4兩種碳青霉烯酶。⑵我院的腸桿菌科超級細(xì)菌主要是NDM-1型，其次是KPC-2型和IMP-4型。非發(fā)酵超級細(xì)菌中鮑曼不動桿菌主要產(chǎn)OXA類碳青霉烯酶，銅綠假單胞菌主要產(chǎn)IMP和VIM酶，與國內(nèi)外研究一致。⑶腸桿菌科超級細(xì)菌和非發(fā)酵超級細(xì)菌中鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合子、ISCR1的陽性率較高，銅綠假單胞菌中二者檢出率較

22、低，但含有的基因盒類型多。所有超級細(xì)菌中共有兩種新型復(fù)雜性Ⅰ類整合了結(jié)構(gòu)檢出。⑷超級細(xì)菌對碳青霉烯耐藥的主要原因是產(chǎn)生碳青霉烯酶，尤以KPC型的和NDM型的酶耐藥譜更為廣泛，水解作用更強(qiáng)，整合子和ISCR等移動耐藥元件在耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移方面有一定的作用，參與介導(dǎo)細(xì)菌對多種抗生素耐藥，特別是氨基糖苷類、喹諾酮類和β內(nèi)酰胺類。但總的來說細(xì)菌耐藥機(jī)制是個(gè)復(fù)雜的過程，通常是多個(gè)機(jī)制共同作用的結(jié)果。⑸成功地建立了一種快速、敏感、特異的雙重?zé)晒舛?/p>