Sonic hedgehog在乳腺癌中的表達(dá)及其表達(dá)變化的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、前言:乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居?jì)D科腫瘤的首位。乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟的過(guò)程，涉及多種癌基因、腫瘤抑制基因和DNA甲基化等遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變。Hh信號(hào)通路對(duì)人類的胚胎期的組織發(fā)育起著非常關(guān)鍵的作用，它能決定四肢的左右對(duì)稱性和前后軸的形成，以及大腦、脊髓、顱面結(jié)構(gòu)、肺、牙齒和眼睛等器官的模式。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)的激活與包括乳腺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　 目前，在哺

2、乳動(dòng)物體內(nèi)的三種Hh同源物質(zhì)中，以Sonic hedgehog(Shh)最受到關(guān)注?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞分泌的Shh分子與其受體Patched(1PTCHl和PTCH2)結(jié)合后，Patched的伙伴分子Smoothened擺脫了Patched對(duì)它的抑制，從而激發(fā)了一系列的通路級(jí)聯(lián)事件。已有研究表明Shh在乳腺癌中的表達(dá)上調(diào)，但是未對(duì)其過(guò)度表達(dá)的原因進(jìn)行分析，因此本研究主要目的就是檢測(cè)Shh在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，分析它們與乳腺癌

3、臨床病理因素的關(guān)系，并初步探討了Shh在乳腺癌中表達(dá)異常的可能機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1、本研究選取了97例乳腺癌標(biāo)本以及22例癌旁乳腺組織標(biāo)本，均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院2004-2007年腫瘤外科手術(shù)切除的標(biāo)本蠟塊，采用SP免疫組織化學(xué)的方法對(duì)組織中Shh的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)及評(píng)分，分析Shh與臨床病理學(xué)指數(shù)的關(guān)系。同時(shí)利用Western blotting的方法對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435、MD

4、A-MB-231、MCF-7以及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中Shh的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2、從乳腺組織標(biāo)本中提取DNA，包括6l例乳腺癌標(biāo)本以及15例癌旁乳腺組織標(biāo)本，進(jìn)行特異性甲基化PCR(MS-PCR)，在癌旁乳腺組織及癌組織中檢測(cè)Shh啟動(dòng)子甲基化的水平，探討Shh啟動(dòng)子的甲基化與Shh表達(dá)水平異常的關(guān)系。同時(shí)利用MS-PCR檢測(cè)四種細(xì)胞系中Shh啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，并應(yīng)用去甲基化試劑5-氮雜胞苷，觀察細(xì)胞系中Sh

5、h的表達(dá)變化。
　　 3、選取了95例乳腺癌標(biāo)本以及11例癌旁乳腺組織標(biāo)本，采用S-P免疫組織化學(xué)方法對(duì)組織中NF-κB的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析NF-κB的表達(dá)與Shh表達(dá)之間的相關(guān)性。
　　 4、應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)Shh信號(hào)通路的特異性阻滯劑Cyclopamine對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435和MCF-7在增殖及凋亡方面的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、Shh主要在細(xì)胞漿中表達(dá)。在癌旁

6、乳腺導(dǎo)管上皮組織中，Shh平均染色強(qiáng)度為2.95±1.91，而在癌組織中平均染色強(qiáng)度為5.25±2.88。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示癌組織中Shh的表達(dá)水平要明顯高于癌旁組織(P＜0.001)。在22例癌旁組織中有18例(81.8％)表達(dá)為陰性，有4例(18.2％)表達(dá)為陽(yáng)性，而在97例腫瘤組織中，47例(48.5％)表達(dá)為陰性，有50例(51.5％)表達(dá)為陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示癌組織中Shh的表達(dá)陽(yáng)性率要明顯高于癌旁組織(p=-0.005)。Shh

7、的表達(dá)水平與臨床分期呈明顯的負(fù)相關(guān)，與腫瘤抑制基因p53表達(dá)呈正相關(guān)性。在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A中Shh表達(dá)很低，在MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435三種乳腺癌細(xì)胞中也都有Shh表達(dá)，表達(dá)水平由高到低分別是MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。
　　 2、MS-PCR結(jié)果顯示在33例Shh表達(dá)陰性的樣本中，有19例(57.6％)發(fā)生了啟動(dòng)子甲基化。相反的，在28例Shh表達(dá)陽(yáng)性的樣

8、本中，只有4例(14.3％)發(fā)生了啟動(dòng)子甲基化。發(fā)生甲基化的標(biāo)本多數(shù)是癌旁乳腺導(dǎo)管上皮組織，同時(shí)伴隨著Shh蛋白的低水平表達(dá)，而多數(shù)腫瘤組織樣本沒(méi)有甲基化現(xiàn)象的發(fā)生，Shh蛋白則出現(xiàn)較強(qiáng)表達(dá)。5-氮雜胞苷(20μM)處理72小時(shí)后，無(wú)論是MDA-MB-435細(xì)胞還是MCF-10A細(xì)胞的Shh啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度都明顯減弱，且Shh蛋白表達(dá)水平明顯升高。
　　 3、乳腺組織中NF-kB的表達(dá)水平與Shh的表達(dá)水平呈明顯的正相關(guān)(P

9、＜0.001)，在56例Shh表達(dá)陰性的樣本中，有37例(66.1％)同時(shí)伴有NF-κB的表達(dá)下調(diào)。相反的，在49例Shh表達(dá)陽(yáng)性的樣本中，只有35例(71.4％)也同時(shí)伴有NF-κB的表達(dá)上調(diào)。
　　 4、不同濃度的Cyclopamine作用于乳腺癌細(xì)胞系72h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示Cyclopamine可抑制MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞的增殖。20μmol/L的Cyclopamine作用72h后，對(duì)MCF-7細(xì)胞

10、的細(xì)胞周期沒(méi)有任何影響，也沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，而當(dāng)Cyclopamine(20μ mol/L)處理MDA-MB-435細(xì)胞72h后，MDA-MB-435出現(xiàn)了明顯的凋亡峰。流式細(xì)胞儀分析了細(xì)胞線粒體膜電位的結(jié)果表明20μmol/L的Cyclopamine作用72h后，MDA-MB-435細(xì)胞的線粒體膜電位降低37％。
　　 結(jié)論:
　　 1、Shh在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁乳腺上皮組織；Shh的表達(dá)水平與臨

11、床分期呈負(fù)相關(guān)，與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 2、Shh啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài)與Shh的表達(dá)水平密切相關(guān)，提示啟動(dòng)子甲基化可能是影響Shh表達(dá)水平的重要調(diào)節(jié)機(jī)制；DNA去甲基化試劑5-氮雜胞苷可降低乳腺細(xì)胞Shh啟動(dòng)子甲基化水平并增加Shh蛋白表達(dá)。
　　 3、乳腺癌組織中NF-κB表達(dá)水平與Shh呈明顯的正相關(guān)，這提示NF-κB表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致Shh過(guò)度表達(dá)的原因之一。
　　 4、Shh信號(hào)通路阻滯劑Cycl