Sonic hedgehog在乳腺癌中的表達及其表達變化的調(diào)節(jié)機制.pdf

1、前言:乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居婦科腫瘤的首位。乳腺癌的發(fā)生是一個多基因、多步驟的過程，涉及多種癌基因、腫瘤抑制基因和DNA甲基化等遺傳學和表觀遺傳學的改變。Hh信號通路對人類的胚胎期的組織發(fā)育起著非常關鍵的作用，它能決定四肢的左右對稱性和前后軸的形成，以及大腦、脊髓、顱面結(jié)構(gòu)、肺、牙齒和眼睛等器官的模式。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)Hh信號的激活與包括乳腺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。
　　 目前，在哺

2、乳動物體內(nèi)的三種Hh同源物質(zhì)中，以Sonic hedgehog(Shh)最受到關注?，F(xiàn)在的觀點認為，細胞分泌的Shh分子與其受體Patched(1PTCHl和PTCH2)結(jié)合后，Patched的伙伴分子Smoothened擺脫了Patched對它的抑制，從而激發(fā)了一系列的通路級聯(lián)事件。已有研究表明Shh在乳腺癌中的表達上調(diào)，但是未對其過度表達的原因進行分析，因此本研究主要目的就是檢測Shh在乳腺癌及癌旁組織中的表達水平，分析它們與乳腺癌

3、臨床病理因素的關系，并初步探討了Shh在乳腺癌中表達異常的可能機制。
　　 材料與方法:
　　 1、本研究選取了97例乳腺癌標本以及22例癌旁乳腺組織標本，均來自中國醫(yī)科大學附屬第一臨床學院2004-2007年腫瘤外科手術切除的標本蠟塊，采用SP免疫組織化學的方法對組織中Shh的表達進行檢測及評分，分析Shh與臨床病理學指數(shù)的關系。同時利用Western blotting的方法對三種乳腺癌細胞系MDA-MB-435、MD

4、A-MB-231、MCF-7以及正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中Shh的表達進行檢測。
　　 2、從乳腺組織標本中提取DNA，包括6l例乳腺癌標本以及15例癌旁乳腺組織標本，進行特異性甲基化PCR(MS-PCR)，在癌旁乳腺組織及癌組織中檢測Shh啟動子甲基化的水平，探討Shh啟動子的甲基化與Shh表達水平異常的關系。同時利用MS-PCR檢測四種細胞系中Shh啟動子的甲基化狀態(tài)，并應用去甲基化試劑5-氮雜胞苷，觀察細胞系中Sh

5、h的表達變化。
　　 3、選取了95例乳腺癌標本以及11例癌旁乳腺組織標本，采用S-P免疫組織化學方法對組織中NF-κB的表達進行檢測，分析NF-κB的表達與Shh表達之間的相關性。
　　 4、應用MTT、流式細胞術等方法檢測Shh信號通路的特異性阻滯劑Cyclopamine對乳腺癌細胞系MDA-MB-435和MCF-7在增殖及凋亡方面的影響。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、Shh主要在細胞漿中表達。在癌旁

6、乳腺導管上皮組織中，Shh平均染色強度為2.95±1.91，而在癌組織中平均染色強度為5.25±2.88。統(tǒng)計學分析顯示癌組織中Shh的表達水平要明顯高于癌旁組織(P＜0.001)。在22例癌旁組織中有18例(81.8％)表達為陰性，有4例(18.2％)表達為陽性，而在97例腫瘤組織中，47例(48.5％)表達為陰性，有50例(51.5％)表達為陽性，統(tǒng)計學分析顯示癌組織中Shh的表達陽性率要明顯高于癌旁組織(p=-0.005)。Shh

7、的表達水平與臨床分期呈明顯的負相關，與腫瘤抑制基因p53表達呈正相關性。在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中Shh表達很低，在MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435三種乳腺癌細胞中也都有Shh表達，表達水平由高到低分別是MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435。
　　 2、MS-PCR結(jié)果顯示在33例Shh表達陰性的樣本中，有19例(57.6％)發(fā)生了啟動子甲基化。相反的，在28例Shh表達陽性的樣

8、本中，只有4例(14.3％)發(fā)生了啟動子甲基化。發(fā)生甲基化的標本多數(shù)是癌旁乳腺導管上皮組織，同時伴隨著Shh蛋白的低水平表達，而多數(shù)腫瘤組織樣本沒有甲基化現(xiàn)象的發(fā)生，Shh蛋白則出現(xiàn)較強表達。5-氮雜胞苷(20μM)處理72小時后，無論是MDA-MB-435細胞還是MCF-10A細胞的Shh啟動子區(qū)域甲基化程度都明顯減弱，且Shh蛋白表達水平明顯升高。
　　 3、乳腺組織中NF-kB的表達水平與Shh的表達水平呈明顯的正相關(P

9、＜0.001)，在56例Shh表達陰性的樣本中，有37例(66.1％)同時伴有NF-κB的表達下調(diào)。相反的，在49例Shh表達陽性的樣本中，只有35例(71.4％)也同時伴有NF-κB的表達上調(diào)。
　　 4、不同濃度的Cyclopamine作用于乳腺癌細胞系72h后進行MTT檢測，結(jié)果顯示Cyclopamine可抑制MCF-7和MDA-MB-435細胞的增殖。20μmol/L的Cyclopamine作用72h后，對MCF-7細胞

10、的細胞周期沒有任何影響，也沒有誘導細胞凋亡的產(chǎn)生，而當Cyclopamine(20μ mol/L)處理MDA-MB-435細胞72h后，MDA-MB-435出現(xiàn)了明顯的凋亡峰。流式細胞儀分析了細胞線粒體膜電位的結(jié)果表明20μmol/L的Cyclopamine作用72h后，MDA-MB-435細胞的線粒體膜電位降低37％。
　　 結(jié)論:
　　 1、Shh在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁乳腺上皮組織；Shh的表達水平與臨

11、床分期呈負相關，與p53蛋白表達呈正相關。
　　 2、Shh啟動子甲基化的狀態(tài)與Shh的表達水平密切相關，提示啟動子甲基化可能是影響Shh表達水平的重要調(diào)節(jié)機制；DNA去甲基化試劑5-氮雜胞苷可降低乳腺細胞Shh啟動子甲基化水平并增加Shh蛋白表達。
　　 3、乳腺癌組織中NF-κB表達水平與Shh呈明顯的正相關，這提示NF-κB表達異常可能是導致Shh過度表達的原因之一。
　　 4、Shh信號通路阻滯劑Cycl