乙型肝炎病毒載體表達的APOBEC3C抗病毒作用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的主要臨床表現(xiàn)是慢性乙型肝炎，迄今慢性乙型肝炎的治療效果很不理想，所以科研人員都在積極探索新的治療策略。Natsoulis等于90年代初率先提出了一種全新的抗病毒策略：利用衣殼蛋白靶向滅活病毒(capsid targeted viral inactivation，CTVI)，他們將這個方法應用于治療逆轉錄病毒的實驗研究，這個方法的主要原理是構建抗病毒蛋白與衣殼蛋白重組形成的融

2、合蛋白，病毒組裝時很多衣殼蛋白單體聚合形成衣殼蛋白，融合蛋白可以被病毒當做真的衣殼蛋白單體被組裝到病毒核心顆粒中，這樣融合蛋白攜帶的抗病毒蛋白就可以直接作用于核心顆粒內部的病毒核酸，干擾核酸合成使之發(fā)生變異失去作用或直接破壞清除病毒核酸，從而達到控制病毒復制的目標。
　　 2001年Beterams和Nassal將這個方法擴展到HBV的實驗研究。他們在HBV核心蛋白羧基端通過linker連接核酸酶(staphylococcal

3、nuclease，SN)。構建SN與核心蛋白的融合蛋白，這種被命名為Core-SN的融合蛋白被裝配到病毒核心顆粒中。在與HBV質粒共轉染人肝癌細胞后，提取上清液檢測HBV DNA，發(fā)現(xiàn)。DNA滴度下降了95％，實驗顯示Core-SN對核心蛋白和RNA形成核心顆粒沒有影響，然而干擾了核心顆粒內部DNA的合成。這個實驗也有不足之處：鈣離子濃度高的情況下SN才能發(fā)揮功能，然而鈣離子濃度在細胞內比較低，也就是說SN對細胞內的病毒沒有作用，只是對

4、分泌到細胞外的病毒發(fā)揮作用，當然就更不能阻止細胞質內的：HBV DNA進入細胞核轉化為cccDNA，所以我們應當尋找能在細胞內直接發(fā)揮抗HBV作用的物質。
　　 載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalyticpolypeptide，APOBEC)是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有脫氨基作用的一類酶，可以使腺嘌呤(adenine，A)或胞嘧啶(cytosine，C

5、)脫氨基分別轉化為次黃嘌呤(inosine，I)或尿嘧啶(uracil，U)，即A→I或C→U。2007年Thomas報道，APOBEC3C(A3C)對HBV具有抑制作用，HBV核心蛋白與A3C復合體非常穩(wěn)定，A3C可以使多數(shù)的新合成HBVDNA基因組出現(xiàn)很多鳥嘌呤(guanine，G)→腺嘌呤突變，即G→A。這些研究結果表明HBV非常容易受到內源性人脫氨酶的影響，并提示A3C是機體固有的抗HBV宿主反應因子。然而A3C不容易進入核心顆

6、粒內部。為此我們利用核衣殼導向的病毒滅活策略構建核心蛋白與A3C的融合蛋白，在核心蛋白組裝時將A3C帶進核心顆粒內部以便其更有效的發(fā)揮抗病毒作用。
　　 本實驗分為兩部分：第一部分我們研究A3C蛋白獨立的抗HBV作用和機制。在第二部分我們利用核衣殼導向的病毒滅活策略構建核心蛋白與A3C的融合蛋白，觀察Core-A3C融合蛋白的抗HBV作用和機制。主要方法是應用電化學發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence i

7、mmunoassay，ECLIA)檢測細胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達水平；應用Southern blotting方法檢測細胞裂解液和上清液中HBV DNA觀察抗病毒作用及pCH-LJ3-A3C在輔助質粒存在下的復制能力；應用3D-PCR技術擴增核心蛋白相關的HBV DNA，測定HBV DNA序列，研究Core-A3C融合蛋白抑制病毒機制；應用免疫細胞化學方法研究融合蛋白在細胞中的定位。
　　 主要研究結果如下：

8、>　　 第一部分：復制缺損型HBV載體表達A3C抗HBV作用。應用PCR技術擴增目的基因A3C，經過XhoⅠ和BSP1407Ⅰ雙酶切替換pCH-LJ3-hrGFP中的hrGFP基因，構建質粒pCH-LJ3-A3C，質粒經酶切和測序鑒定正確。質粒pCH-LJ3一A3C與野生型HBV質粒pCH-3093共轉染HepG2細胞系。首先，應用ECLIA法檢測細胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達水平。結果顯示pCH-LJ3-A3C組HBsA

9、g表達水平為對照組的104.4％％±2.25％；HBeAg表達水平為對照組的98.65％±0.85％，與對照組相比，均無統(tǒng)計學差異。隨后，應用Southern blotting方法檢測細胞裂解液和上清液HBV DNA，觀察DCH-LJ3-A3C的抗病毒作用。結果顯示pCH-LJ3-A3C可以抑制細胞漿內病毒DNA，使HBV DNA減少30％，pCH-LJ3-A3C可以抑制上清液中子代病毒顆粒使HBV DNA減少39％。之后，為了研究pC

10、H-LJ3-A3C能否在輔助質粒幫助下恢復復制能力，pCH-LJ3-A3C與pCH-3142共轉染HepG2細胞系，Southern blotting方法檢測細胞裂解液和上清液HBVDNA。結果顯示裂解液和上清液均檢出病毒DNA。最后，為了研究其抑制病毒機制，應用3D-PCR技術擴增核心顆粒有關的HBV DNA，與pGEM-T測序載體連接，每組選取50個克隆測序。結果回報pCH-LJ3-A3C對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能產生了G

11、→A的變異，總共36個克隆出現(xiàn)G→A的變異，G→A變異總數(shù)目達982。
　　 第二部分：HBV載體表達核心蛋白與A3C融合蛋白抗HBV作用。應用PCR技術擴增目的基因A3C，經過BstEⅡ和Acor13HⅠ雙酶切，插入載體質粒pdssX中，構建質粒pCH-Core-A3C，質粒經酶切和測序鑒定正確。pCH-Core-A3C與野生型HBV質粒pCH-3093共轉染HepG2細胞系。首先，應用ECLIA法檢測細胞培養(yǎng)上清中HBsAg

12、和HBeAg的表達水平。結果顯示pCH-Core-A3C組HBsAg表達水平為對照組的97.82％±1.37％，HBeAg表達水平為對照組的97.16％±0.86％，與對照組相比無統(tǒng)計學差異。隨后，應用Southern blotting方法檢測細胞裂解液和上清液HBV DNA，觀察pCH-Core-A3C的抗病毒作用。結果顯示pCH-Core-A3C可以抑制細胞漿內病毒DNA，使HBV DNA減少84％，pCH-Core-A3C可以抑制

13、上清液中子代病毒顆粒使HBV DNA減少91％。之后，為了研究其抑制病毒機制，應用3D-PCR技術擴增核心顆粒有關的HBV DNA，與pGEM-T測序載體連接，每組選取50個克隆測序。結果回報pCH-Core-A3C對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能，產生了大量的G→A的變異，總共48個克隆出現(xiàn)G→A的變異，G→A變異總數(shù)目達2416。最后，應用免疫細胞化學方法研究融合蛋白在細胞中的定位。結果顯示Core-A3C融合蛋白主要定位于細胞

14、漿。
　　 綜合前兩部分研究我們得出主要研究結論如下：
　　 1.成功構建了HBV載體表達核心蛋白與A3C融合蛋白質粒pCH-Core-A3C；復制缺損型HBV載體表達A3C質粒pCH-LJ3-A3C。
　　 2.pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C質粒對細胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達水平沒有影響。
　　 3.pCH-Core-A3C轉染HepG2細胞系，細胞免疫化學顯示Core-

15、A3C融合蛋白主要定位于細胞漿。
　　 4.pCH-LJ3-A3C在輔助質粒pCH-3142提供包裝時形成了完整的HBV顆粒。
　　 5.與野生型HBV質粒pCH-3093共轉染HepG2細胞系，Southern blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均可以抑制細胞裂解液和細胞上清液HBVDNA，且pCH-Core-A3C抑制病毒復制作用明顯優(yōu)于pCH-LJ3-A3C。
　　

16、 6.應用3D-PCR技術擴增核心顆粒有關的HBV DNA并克隆至pGEM-T載體，每組選取50個克隆測序，pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能產生了G→A的變異，且pCH-Core-A3C的編輯作用明顯優(yōu)于pCH-LJ3-A3C。
　　 總之，我們構建了表達Core-A3C的HBV載體，發(fā)現(xiàn)其對野生型HBV具有較強的的編輯作用，同時還能在輔助病毒存在時形成子代病毒，為下一步的動