熒光標記重組乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:把乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）改造為攜帶外源基因的復(fù)制型載體，可視化的觀察HBV的表達與復(fù)制。
　　方法:
　　1、利用PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建表達切開綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)1-10片段的質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10;構(gòu)建表達GFP11片段的載體質(zhì)粒: pCH-GFP11-Core, pCH-GFP11-BsdR和pCH-GFP11-S

2、2。
　　2、質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10分別與表達GFP11的載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core，pCH-GFP11-BsdR和pCH-GFP11-S2共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2細胞，觀察GFP表達的強度和特點。
　　3、載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core，pCH-GFP11-BsdR和pCH-GFP11-S2分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后第五天提取細胞裂解液中的DNA，用southernblot檢測HBV復(fù)制水平

3、。
　　4、載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core及表達野生型HBV的對照質(zhì)粒pCH-9/3093分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，細胞裂解液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，應(yīng)用mc312PO抗體檢測重組HBV核心顆粒的形成。
　　5、質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10與載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后24h加抑制核心蛋白聚合的藥物Bay41-4109，對照組加相同濃度無活性的Bay41-4842，加

4、藥后24h在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光變化。
　　6、用本實驗室構(gòu)建保存的表達發(fā)卡狀小干擾RNA(shRNA)的質(zhì)粒pBS-shHBV6共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后48h在熒光顯微鏡下觀察各組細胞內(nèi)熒光變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:Split GFP11片段與HBV核心蛋白N端形成融合蛋白的研究
　　1、重組質(zhì)粒pCH-GFP11-Core的構(gòu)建:以表達野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093作為載體，該載體包

5、含1.05倍的HBV全基因組，基因組前置入了一個CMV啟動子，替代HBV自身的C基因啟動子，用于驅(qū)動前基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。在HBV核心蛋白N端插入GFP11序列。GFP11序列為:CGG GAC CAC ATG GTG CTG CAC GAG TAC GTG AAC GCCGCC GGC ATC ACA，插入到HBV核心蛋白N端第9位核苷酸之后，再以一個親水短肽GGC GAC GGC GGC AGC GGC GGC GGa tcC GG

6、T連接，形成GFP11-Core融合蛋白，所構(gòu)建的pCH-GFP11-Core載體質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及序列測定證實。
　　2、重組HBV的熒光表達:質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10與載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后48h在熒光顯微鏡下可觀察到細胞內(nèi)很強的綠色熒光表達，以細胞核為主，這一結(jié)果與公認的HBV核心蛋白的正常分布一致。
　　3、重組HBV核心蛋白顆粒的形成:載體質(zhì)粒pCH-GFP

7、11-Core及表達野生型HBV的對照質(zhì)粒pCH-9/3093分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，細胞裂解液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，應(yīng)用mc312PO抗體檢測到重組HBV核心顆粒的形成，二者比較在相近的電泳位置，說明GFP11-Core融合蛋白能夠形成完整的核心蛋白顆粒。
　　4、重組HBV的復(fù)制能力:載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core以表達野生型HBV的對照質(zhì)粒pCH-9/3093分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，提取細胞裂解液中的D

8、NA，用Southern blot檢測HBV復(fù)制水平，該載體未檢測到HBV復(fù)制中間體，而對照質(zhì)粒pCH-9/3093可檢測到HBV DNA。
　　5、熒光示蹤觀察Bay41-4109對HBV核心蛋白的影響:質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10與載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后24h加入1μM的抑制HBV核心蛋白聚合的藥物Bay41-4109，對照組加入相同濃度無活性的Bay41-4842，加藥后24h在

9、熒光顯微鏡下觀察熒光的變化，加用Bay41-4109組熒光主要在核膜表達，對照組熒光無變化，仍主要在胞核表達。
　　6、小干擾RNA抑制作用:用本實驗室構(gòu)建保存的表達發(fā)卡狀小干擾RNA(shRNA)的質(zhì)粒pBS-shHBV6與質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10和載體質(zhì)粒pCH-GFP11-Core共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，加用pBS-shHBV6組熒光強度明顯減弱，帶有熒光的細胞數(shù)也顯著減少。
　　第二部分:Split GFP11

10、片段與殺稻瘟菌素抗性基因的融合蛋白在HBV核心蛋白與P蛋白之間表達的研究
　　1、重組質(zhì)粒pCH-GFP11-BsdR的構(gòu)建:以本實驗室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pCH-BsdR作為載體，將GFP11與BsdR形成融合蛋白插入HBV核心蛋白與P蛋白之間，GFP及l(fā)inker序列同第一部分。
　　2、重組HBV的熒光表達:質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10與載體質(zhì)粒pCH-GFP11-BsdR共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后48h在熒光顯微鏡下

11、可觀察到細胞內(nèi)很強的綠色熒光，胞漿和胞核均等表達。
　　3、重組HBV的復(fù)制能力:載體質(zhì)粒pCH-GFP11-BsdR以表達野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093和前期構(gòu)建的載體質(zhì)粒pCH-BsdR為對照分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，提取細胞裂解液中的DNA，用Southern blot檢測HBV復(fù)制水平。該載體pCH-GFP11-BsdR中HBV DNA的條帶分布模式均與pCH-9/3093轉(zhuǎn)染后相似。圖像經(jīng)計算機軟件定量分析顯示，在

12、總DNA層面，pCH-BsdR轉(zhuǎn)染組HBV DNA的量相當于pCH-9/3093的40-45％，pCH-GFP11-BsdR的HBV DNA量稍減，但仍可達pCH-9/3093的20％。
　　4、小干擾RNA抑制作用:用質(zhì)粒pBS-shHBV6與質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10和載體質(zhì)粒pCH-GFP11-BsdR共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，加用pBS-shHBV6組熒光強度明顯減弱，帶有熒光的細胞數(shù)顯著減少。
　　第三部分:Sp

13、lit GFP11與HBV前S2蛋白形成融合蛋白的研究
　　1、重組質(zhì)粒pCH-GFP11-S2的構(gòu)建:以表達野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093作為載體，在HBV前S2區(qū)插入GFP11序列，GFP11及l(fā)inker序列同第一部分，將前S1，S2的起始密碼突變?yōu)锳CG，GFP11與前S2形成融合蛋白，GFP11在HBV前S2起始位置。所構(gòu)建的pCH-GFP11-S2載體質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及序列測定證實。
　　2、重組HBV的熒

14、光表達:質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10與載體質(zhì)粒pCH-GFP11-S2共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后48h，在熒光顯微鏡下可觀察到細胞內(nèi)較弱的綠色熒光，熒光主要在細胞漿中散在分布。
　　3、重組HBV的復(fù)制能力:載體質(zhì)粒pCH-GFP11-S2及表達野生型HBV的對照質(zhì)粒pCH-9/3093分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，提取細胞裂解液中的DNA，用Southern blot檢測HBV復(fù)制水平。該載體中HBV DNA的條帶分布模式均與p

15、CH-9/3093轉(zhuǎn)染后相似。圖像經(jīng)計算機軟件定量分析顯示，在總DNA層面，pCH-GFP11-S2轉(zhuǎn)染組HBV DNA的量相當于pCH-9/3093的95％，結(jié)果提示該HBV載體幾乎不影響HBV的復(fù)制。
　　4、小干擾RNA抑制作用:用本實驗室構(gòu)建保存的表達發(fā)卡狀小干擾RNA(shRNA)的質(zhì)粒pBS-shHBV6與質(zhì)粒psuCMV-GFP1-10和載體質(zhì)粒pCH-GFP11-S2共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，加用pBS-shHBV6組

16、熒光強度明顯減弱，帶有熒光的細胞數(shù)也顯著減少。
　　結(jié)論:
　　利用綠色熒光蛋白熒光互補技術(shù)，把48bp GFP11小片段插入HBV基因組不同區(qū)域，構(gòu)建了三種重組HBV載體
　　1、在HBV核心蛋白N端插入GFP11，形成融合蛋白，表達熒光強度高，能夠形成核心蛋白顆粒，但失去了復(fù)制能力?？捎糜谟^察HBV核心蛋白的聚合及研究抑制HBV mRNA的藥物。
　　2、在HBV核心蛋白與P蛋白之間插入GFP11-BsdR融