α-黑素細胞刺激素對谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護作用.pdf

1、背景：當(dāng)今世界的主要致盲性眼病包括青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼部疾病。青光眼所致的持續(xù)性高眼壓和糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管損傷，均可使視網(wǎng)膜處于缺血狀態(tài)，進而使谷氨酸在視網(wǎng)膜中的濃度增高，而過多的谷氨酸可造成視網(wǎng)膜興奮性毒性。由此可見，谷氨酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜興奮性毒性是青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變等致盲性眼病的共同病理狀態(tài)。文獻報道，α-黑素細胞刺激素(α-MSH)可拮抗谷氨酸興奮性毒性而導(dǎo)致的腦部海馬神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生。
　　

2、 目的：建立雞胚視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)體系，并在國內(nèi)首次利用該培養(yǎng)體系研究α-MSH對谷氨酸引起的視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護作用。
　　 方法：用胚胎第9天(E9)的雞視網(wǎng)膜建立組織塊培養(yǎng)體系。分別收集體外培養(yǎng)第3、5、7天的視網(wǎng)膜組織塊及第12、14、16天(E12、E14、E16)的雞胚視網(wǎng)膜各3塊進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，觀察各標(biāo)本的視網(wǎng)膜形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)，并用實時PCR法分別檢測不同培養(yǎng)時間點視網(wǎng)膜組織塊中α-MSH受體(MCRs)

3、表達量的動態(tài)變化。然后將視網(wǎng)膜組織塊分為谷氨酸刺激組、α-MSH+谷氨酸刺激組以及正常培養(yǎng)組，分別用谷氨酸及α-MSH+谷氨酸處理48h，用TUNEL染色法檢測各組視網(wǎng)膜組織塊中細胞凋亡情況并進行定量分析;實時PCR法檢測各組視網(wǎng)膜組織塊中神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.培養(yǎng)3、5、7d視網(wǎng)膜組織塊中各層組織結(jié)構(gòu)與E12、E14和E16的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相同。
　　 2.MC1Rm

4、RNA在E9、E12、E14和E16雞視網(wǎng)膜中的表達量明顯低于出生后1d，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001);而MC5RmRNA在E9表達量明顯低于E12及E14（均P=0.000），但此后從E14至P1則逐漸降低;而MC1RmRNA和MC5RmRNA在培養(yǎng)不同時間的視網(wǎng)膜組織塊中的表達量呈現(xiàn)同樣的規(guī)律。
　　 3.TUNEL染色顯示谷氨酸刺激雞胚視網(wǎng)膜組織48h后，視網(wǎng)膜內(nèi)核層和節(jié)細胞層細胞大量凋亡，外核層亦有少量凋亡細胞，

5、DAPI染色結(jié)果表明視網(wǎng)膜各層排列紊亂，但α-MSH+谷氨酸刺激組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)比較規(guī)則。定量結(jié)果表明，谷氨酸刺激組雞胚視網(wǎng)膜每張切片的平均凋亡細胞數(shù)量為（600.80±24.19）個，α-MSH+谷氨酸刺激組為（61.80±15.77）個，正常對照組為（72.4±12.93）個，各組凋亡細胞總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1422.89，P=0.000）;α-MSH+谷氨酸刺激組凋亡細胞數(shù)量明顯少于谷氨酸刺激組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0

6、00）。
　　 4.谷氨酸刺激組視網(wǎng)膜組織塊中GFAPmRNA的相對表達量為2.23±0.06，α-MSH+谷氨酸刺激組為1.14±0.15，正常對照組為1.05±0.04，處理組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.216，P=0.000）。谷氨酸刺激組GFAPmRNA的表達量是正常對照組的2.1倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。α-MSH+谷氨酸刺激組的GFAP表達較谷氨酸刺激組顯著下調(diào)（P=0.000），但與正常對照組